50. Генетическая инжене́рия (генная инженерия) Синтез и выделение генов. Плазмиды. Достиж-я ген. Инжен-ии в медиц-е.

— совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология.

Впервые химический синтез гена осуществил в 1969 г. работающий в США индийский ученый Х.Г.Корана с сотрудниками. Он синтезировал ген (участок молекулы ДНК), кодирующий синтез аланиновой т-РНК пекарских дрожжей. Этот ген состоял из 77 пар нуклеотидов, последовательность которых была известна.

Вначале синтезировали мелкие фрагменты ДНК, содержащие от 4 до 13 нуклеотидных пар, затем с помощью фермента лигазы их соединили в соответствующем порядке, но данный ген был не в состоянии синтезировать аланиновую т-РНК, так как не содержал акцепторной системы.

В 1976 г. в лаборатории Х.Г.Кораны был синтезирован фрагмент су-прессорной тирозиновой т-РНК длиной 126 пар нуклеотидов, промотор,состоящий из 52 пар нуклеотидов, и терминатор, имеющий 21 пару нуклеотидов.

К концам молекулы ДНК были прикреплены так называемые "липкие концы", состоящие из чередования нуклеотидов ААТТ (один конец) и ТТАА (другой конец). Благодаря этому данный ген был встроен в геном фага и нормально в нем фун кционировал .Таки м образом, была показана возможность искусственного синтеза генов. Метод позволяет синтезировать относительно мелкие гены, содержащие небольшое число пар нуклеотидов.

Впервые выделить ген методом трансдукции удалось ДжБексвиту с сотрудниками. Они показали, что бактериофаг X при размножении в клетке Е.СоЫ может захватить и встроить в свой геном полный лактозный оперон бактерии вместе с примыкающим к нему геном-регулятором.

Фрагмент ДНК E.Coli встраивается в геном фага X в строгом порядке: структурные гены, оператор, промотор и регулятор. Применением денатурации и центрифугирования из ДНК-фага был выделен лактозный оперон и ген-регулятор E.Coli.

К сожалению, метод оказался сугубо специфичным для данного гена и не может широко использоваться в генетической инженерии.

Ферментативный синтез. Гены, кодирующие ферменты или структурные белки, состоящие из тысячи и более нуклеотидных пар, рациональнее создавать методом ферментативного синтеза с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы). С помощью данного фермента с м-РНК могут быть получены точные копии ДНК (кДНК).

ДНК может быть выделена из любого биологического материала: из крови и других жидкостей организма, различных типов тканей и клеток, содержащих ядра. У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови. Процесс выделения ДНК состоит из нескольких этапов: быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение и экстрагирование белков, осаждение молекул ДНК в этаноле с последующим их растворением в буферном растворе. Оценку качества выделенной ДНК проводят на основании измерения оптической плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового спектров поглощения. В чистых образцах ДНК соотношение А(260)/А(280) > 1,8; где А(260) и А(280) — оптическая плотность раствора при длине волны 260 и 280 нм, соответственно. Для научных исследований ДНК не только вьщеляют из биологического материала. но и получают синтетически при использовании ДНК-синтезаторов - приборов для автоматического синтеза ДНК. Принципиальное отличие процесса химического синтеза от биологического состоит в присоединении каждого нового нуклеотида к 5'-гидроксильному концу цепи, а не к З'-концу. Наиболее распространенным методом химического синтеза ДНК является фосфорамидитный (фосфиттриэфирный) метод. Для синтеза используют модифицированные дезоксирибонуклеозиды. Для предотвращения неспецифического взаимодействия 5'-гидроксильной группы первого нуклеотида до добавления в реакционную смесь второго нуклеотида ее защищают с помощью диметокситритильной (ДМТ) группы. Каждый последующий присоединяемый к растущей цепи нуклеотид добавляется в колонку в виде фосфорамидита, т.е. содержит ДМТ-группу и диизопропиламинную группу на З'-фосфитной группе, защищенную метильным остатком. Химический синтез необходим для получения одноцепочечных олигонуклеотидов длиной < 50 п.н. Такие олигоиуклеотиды используют для конструирования целых геномов и их фрагментов, в качестве праймеров для амплификации специфических последовательностей и секвенировании ДНК, для сайт-специфического мутагенеза in vitro, в качестве зондов при гибридизации и в качестве линкеров, облегчающих клонирование. Химический синтез применяют при затруднении клонирования гена (если известна аминокислотная последовательность белка). В тех случаях, когда ко-доны гена плохо считываются организмом хозяина, можно синтезировать ген с таким набором кодонов (оптимизация кодонов), который сохраняет аминокислотную последовательность прежней, но транскрибируется более эффективно. Для того чтобы синтезировать ген, необходимо каждую из цепей составляющей его последовательности синтезировать отдельно. При большой протяженности гена его синтезируют отдельными фрагментами, которые впоследствии «собирают» с помощью ДНК-полимеразы иДНК-лигазы. Все молекулярно-генетические методы основаны на использовании различных классов ферментов, два из которых имеют наибольшее значение: ДНК-полимеразы и рестриктазы. ДНК-полимеразы осуществляют синтез ДНК, и для их работы необходима одноцепочечная матричная ДНК с двухцепочечным участком на 3'-конце молекулы и четыре типа дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP: dATP, dCTP, dGTP и dTTP). ДНК-полимеразы обладают различными видами активности, в том числе и экзонуклеазной в направлении 3' -» 5', что позволяет этим ферментам репарировать дефекты, образовавшиеся при синтезе ДНК. Способность ДНК-полимеразы I E. colt инициировать репликацию в месте разрыва ДНК и замещать гомологичный участок в двойной цепи ДНК используется для введения в ДНК меченых нуклеотидов методом никтрансляции, а также для заполнения брешей при сборке протяженного гена из химически синтезированных олигонуклеотидных последовательностей. Основное свойство ДНК-полимераз- осуществлять синтез ДНК — используют при амплификации изучаемого фрагмента ДНК. Одним из видов амплификации является полимеразная цепная реакция.

Плазми́ды — небольшие молекулы ДНК, физически отдельные от геномных хромосом и способные реплицироваться автономно. Как правило, плазмиды встречаются у бактерий и представляют собой двухцепочечные кольцевые молекулы, но изредка плазмиды встречаются также у архей и эукариот.

В природе плазмиды обычно содержат гены, повышающие устойчивость бактерии к неблагоприятным внешним факторам (в т. ч. устойчивость к антибиотикам), нередко они могут передаваться от одной бактерии к другой (иногда даже к бактерии другого вида) и, таким образом, служат средством горизонтального переноса генов.

Генная инженерия оказалась очень перспективной для медицины, прежде всего, в создании новых технологий получения физиологически активных белков, используемых в качестве лекарств (инсулин, соматостатин, интерфероны, соматотропин и другие). Инсулин используют для лечения больных диабетом, который стоит на третьем месте (после болезней сердца и рака) по частоте вызываемых смертельных случаев. Мировая потребность инсулина составляет несколько десятков килограммов. Традиционно его получают из панкреатических желез свиней и коров, но гормоны этих животных слегка отличаются от инсулина человека

Генотерапия

Неблагоприятная экологическая обстановка и целый ряд других подобных причин приводят к тому, что все больше детей рождается с серьезными наследственными дефектами. В настоящее время известно 4000 наследственных заболеваний, для большинства из которых не найдено эффективных способов лечения.

Генные инженеры уже внесли свой вклад в решение этой проблемы, разработав диагностические препараты, позволяющие обнаруживать генетические аномалии в период беременности, что дает возможность предотвратить рождение больного ребенка. Однако более одного процента всех новорожденных имеют генетические заболевания, которые приводят к физическим и умственным нарушениям, а также к ранней смерти..

Трансгенные растения

С этой целью была разработана система переноса в растения различных чужих генов, которые могут сообщать растениям полезные свойства. Наиболее распространен перенос генов с помощью вируса, поражающего фитопатогенную бактерию Agrobacterium tumefaciens. Плазмида найденного в клетках A. tumefaciens способна переносить часть своей ДНК в растительные клетки. Именно в эту ДНК встраивается необходимый "полезный" ген. Растения, в хромосому которых встраивается чужой ген, называются трансгенными.