3. Изучение структуры бактерий при помощи сложных методов окрашивания. Метод Грама.

Цель:научиться технике окраски мазка методом Грама для их дифференциации.

Необходимые принадлежности:световой микроскоп, выращенный на питательной среде культура стафилококка, стрептококка,кишечной палочки, набор по Граму ( генциан-фиолетовый, фуксин, раствор Люголя, 96⁰этиловый спирт), иммерсионноемасло, предметные стёкла, фильтровальная бумага, петля, спиртовка, пипетки, штатив, лоток,мостик, чистая вода в колбе,физиологический раствор.

Порядок работы (шаги).

№	Выполняемые действия	Рисунок действий	Выполнил точно и до конца (балл)
1	Приготовленные и зафик-сированные препараты из культуры стафилококка, стрептококка и кишечной палочки располагают на мостик над лотком и капают краситель генциан фиоле-товый, либо прикладывают пропитанный генциан фиолетовым фильтровальную бумагу на 2 минуты		10
2	После определённого времени убирается фильтровальная бумага и капается раствор Люголя. Держать 1 мин.		10
3	Не смывая, на препарат капают 960этиловый спирт и оставляют до исчезновения окрашивания (30 секунд)		20
4	Препарат хорошо промывается водой		10
5	Препарат докрашивают фуксином Пфейффера( 2-3 мин)		10
6	Препарат хорошо промывается водой и сушится		10
7	На приготовленный препарат наносят иммерсионное масло и микроскопируют		20
8	Нарисовать в тетрадь бактерии, которые окрасились по Граму. Интерпретация результата.		10
Всего			100

Примечание: Ошибки при окрашивани по методу Грама, их значение и избежание повторных ошибок

1. При приготовлении мазка взятие большого колличества культуры микроорганизмов приводит к не качественному их окрашиванию.

Основным дифференцирующим веществом при окрашивание по методу Грама является 96⁰этиловый спирт. Если недодержать спирт, то грампотрицательные бактерии не обесцветятся и останутся фиолетовыми.Если передержать, то грамположительные бактерии потеряют фиолетовое окрашивание, в итоге при окрашивании фуксином могут стать красного цвета. Поэтому при работе со спиртом нужно учитывать время

3- ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

“СТРУКТУРА БАКТЕРИЙ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ В СЛОЖНЫХ МЕТОДАХ ОКРАСКИ. МЕТОД БУРРИ-ГИНСА, МЕТОД ЦИЛЬ-НИЛЬСЕНА”

Цель лабораторной работы .

Изучение отдельных ультраструктурных элементов микроорганизмов с целью диагностики возбудителя инфекций.

Педагогические задачи:

• Объяснить особенности строений микроорганизмов и структуры кислотоустойчивых бактерий;

• Показать окрашивание микроорганизмов по методу Бурри-Гинса и Циль-Нильсена.

Итоги занятия

Студент должен знать:

• Структуру (капсула, особенности клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий) микроорганизмов

• Строение капсулы микроорганизмов и выявление её методом Бурри-Гинса

• Строение клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий и окраску их по методу Циль-Нильсена.

Студент должен уметь:

• Определить капсулу бактерий по методу Бурри-Гинса;

• Определить кислотоустойчивые бактерии по методу Циль-Нильсена.

Лабораторные работы

1.Изучение капсулы бактерий при помощи сложных методов окрашивания. Метод Бурри-Гинс.

2. Изучение кислотоустойчивых бактерий при помощи сложных методов окрашивания - метод Циль-Нильсена.

Лабораторная работа - 1. Изучение капсулы бактерий при помощи сложных методов окрашивания. Метод Бурри-Гинс.

Цель лабораторной работы: научиться технике приготовления мазка, окрашивание бактерий по методу Бурри-Гинса, изучение под микроскопом и выявление капсулы бактерий.

Необходимое оснащение и реактивы: Микроскоп, спиртовка, предметное стекло, лоток, стеклянная подставка, бактериальная петля, вата, бинтовые шарики, пробирки, пипетки. Культура капсульных микробов, 96⁰спирт, набор красителей Бурри-Гинса.

Порядок работы (шаги).

.

№	Выполняемые действия		Техника выполнения		Выполнил точно и до конца (балл)
1	Приготовить необходимое оснащение, зажечь спиртовку и обезжирить предметное стекло.				10
2	На край обезжиренного предметного стекла наносится 1 капля туши				10
3	При помощи петли берётся культура и смешивается с тушью.				10
4	При помощи гладкого стекла размазываем мазок (метод Бурри) (как мазок крови)				15
5	Высушиваем при комнатной температуре и фиксируем (при помощи пламени спиртовки либо метилового спирта)				10
6	Окрашиваем, закапывая на поверхность мазка несколько капель водного раствора фуксина ( 3мин)				10
7	Мазок промываем водой и высушиваем при комнатной температуре.				10
8	Наносим 1 каплю иммерсионнго масла и рассматриваем под микроскопом				10
9	Капсулы Klebsiella sp. отграниченно на чёрном фоне, тело окрашено в красный цвет фуксином.				15
ВСЕГО				100

Лабораторная работа. Изучение кислотоустойчивых бактерий при помощи сложных методов окрашивания. Метод Циль-Нильсена

Цель лабораторной работы: Выявление кислотоустойчивых бактерий.

Необходимое оснащение и реактивы: Микроскоп, спиртовка, предметное стекло, лоток, стеклянная подставка, петля, вата , бинтовые шарики, пробирки, пипетки, резиновые перчатки, агаровая культура кислотоустойчивых бактерий в пробирке, 96⁰спирт, набор красок Циль-Нильсена.

Порядок работы (шаги).

№	Выполняемое действие	Техника выполнения	Выполнил точно и до конца (балл)
1	Приготовить мазок из культуры кислотоустойчивых бактерий и зафиксировать		10
2	Наложить на поверхность мазка порезанную на квадратики чистую фильтровальную бумагу. Сверху фильтровальной бумаги нанести несколько капель карболового-фуксина (фукcин Циля)		10
3	Держим над спиртовкой до появления пара-3раза (не должно закипеть)		10
4	После охлаждения препарата бумагу убираем. Не смывая держим мазок под раствором 5% H2SO4 (30 секунд)		10
5	Промывается водой		10
6	Вновь окрашивается -метиленовым-синим (3-5 мин)		10
7	Промывается водой		5
8	Мазок высушивается		5
9	На мазок нанести 1 каплю иммерсионного масла и микроскопировать		15
10	Кислотоустойчивая бактерия по Циль-Нильсену будет окрашен на голубом фоне в красный цвет. Зарисовать увиденное в тетрадь.		15
	ВСЕГО		100

Примечание: Возможные ошибки при окрашивани по методу Бурри-Гинса и Циль-Нильсена, их значение и устранение.

2. В обоих случаях взятия избыточного количества культуры ведёт к не качественному окрашиванию мазка.

3. При окрашивании по методу Циль-Нильсена основным дифферецирующим веществом является раствор 5% H₂SO_4. При недостаточном помещении мазка в растворе H₂SO₄ кислотонеустойчивые бактерии не обесцветятся и не потеряют красный цвет. Если больше продержать, то кислотоустойчивые бактерии потеряют окраску фуксином и могут окраситься метиленовым синим. Следовательно, при окрашивании по методу Циль-Нильсена большое внимание уделяется времени наH₂SO₄ .

4. Так же при окрашивании по методу Циль-Нильсена необходимо быть осторожным при поднесении мазка к спиртовке до появления пара, потому что, если вместо образования пара у нас закипит фуксин то бактерии начнут распадаться, а если меньше держать, то плохо окрасятся фуксином.