Лабораторная работа №17

«МЕТОДЫ ОЦЕНКИ Т И В-ЛИМФОЦИТОВ. ПРИНЦИП ПРИМЕНЕНИЯ ЦИТОФЛЮОРИМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА»

Цель лабораторной работы.

-Ознакомление современными способами оценки иммунной статуса

Задачи педагога:

- Напомнить студентам о значении иммунной системой, а именно, Т- и В-лимфоцитов;

- Ознакомить студентов с современными способами оценки клеточной и гуморальной факторов иммунной системы.

Результаты лабораторной работы

Студент должен знать:

- Строение иммунной системы, Т- и В-лимфоциты и их значение

- Методы оценки клеточной и гуморальной системы иммунитета, суть и механизм.

Студент должен уметь:

- Оценивать иммунную систему макроорганизма по результатам цитофлюориметрического метода оценки Т- и В-лимфоцитов

Определение Т- и В- лимфоцитов и их субпопуляций современными методами.

Проточный цитофлюориметрический метод(ПЦМ) – этот метод отличется своей быстротой и специфичностью и применяется в анализе клеток крови. В диагностической практике ПЦМ широко применяется при оценке иммунологического статусаорганизма, в онкологии, гематологии, фармакологии.

Преимущества и сфера применения ТЦМ:

-Количественнаяцитометрия – сравнительно новый метод в практике микробиологии, проводятся исследования специальными приборами в дисперсионной среде. Цитометрия может быть статистической или текущей.

В статистической цитометрии используется конфокальные микроскопы для исследований; если нет таких микроскопов, то можно проводитьисследование более дешевым люминесцентным микроскопом, то есть с помощью меченных флюрохромом моноклоналных антител, которые дадут свечение.

Проточная цитометрия - это такой метод, при котором суспензия клеток подается в вибрирующую проточную камеру с форсункой, выбрасывающей капли жидкости , в каждой из которых содержится единственная клетка. Капля проходит сквозь лазерный пучок и расскивают свет. Светорассеяние измеряется с помощью фотоумножителя. .Прямое светорассеяние коррелирует с размером клеток. Боковое светорассеяние (под углом 90º ) коррелирует с гранулярностью клетки и ядерно-цитоплазматическим отношением. Этот метод позволяет отличить крупные клетки с низким ядерно-цитоплазматическим отношением и гранулами в цитоплазме (гранулоциты) от мелких клеток с крупным ядерно-цитоплазматическим отношением (лимфоциты). Сортирование клеток можно проанализировать другим параметром, например их флюоресценцию. Эти частицы учитываются с помощью меченных флюрохромом моноклоналных антител или с помощью радиоактивных веществ. Каждый из количественных цитометрических методов широко применяется в медицинской практике и биологии. Метод поточной цитометрии был создан для определения количестваи размеров частиц в спец. экспериментах.

В современнойпоточной цитометрии применяется два типа аппаратов:

*Первый типдля определения флюоресценции используется аппарат определяюший свет двухволновой длины, распространяющийся под углом 10º и 90º градусов.

*Вторым типом можно определить в сложных смесях частицы и ядра, исследовать более пяти параметров, а также параметры различных клеток

На сегодняшний день определяемые параметры разные и сложные, требуют особой систематики.

Биологические пробы клеток во время исследования приготавливаются.

• Из крови

• Из костного мозга

• Из ликвора

• Из синовиальной жидкости

• Из плевральной жидкости

• Из перитонеальной жидкости

• Из опухолей или здоровых тканей

Рисунок 69. Работа с цитометрическим аппаратом.

Последователность выполненияпроточной цитометрии.

Принцип выполнение этого метода очень прост. Исследуемая суспензия клетки перерабатывается моноклональными антителами и располагается в поток дисперсной среды, то есть переводяший поток ячейки.

С помощью определенных волн лучей можно получить анализ параметров нескольких клеток в результате возбуждения молекул.

При использование проточной цитометрии специфическая дисперсионная среда(моноклоналные антитела) отмечается со специальными флюоресцирующими красками – флюрохромами.

Самымлучшим в проточной цитометриифлуорохромом считается йодистый пропидий, его спектральная характеристика считается идеальным для проведения проточной цитометрии.

Преимущество ТЦ:

• Быстрота скорости получения результата

• Имеет возможность определитьбольшое количество клеток.

• Можно определить субпопуляции одной клетки

• Определяет параметры любых структур

• Самая высокая степен объективности.

В иммунологии применяется в следующих целях.

• При определении иммунофенотипов клеток крови

• При определение фагоцитарной активности иммунных клеток

• При идентификации внутриклеточных белков

• При изучении пролиферативной активности клеток

• При определение цикла клетки

• При определении цитотоксической активности

На сегодняшний день в иммунологических лабораториях с помощью поточной цитометрии можно определить следующие параметры иммунной системы.

- Состав субпопуляции лимфоцитов в периферической крови

(CD40+CD3+; CD3-CD19+; CD3+CD4+; CD3+CD8+; индекс иммунорегулятора. CD3+CD4+/CD3+CD8+) . Для выявления течения острых и хронических болезней, связанных с иммунной системой, мониторинг терапии.

-Для определения количества СD25 экспрессивных лейкоцитов (CD3+CD25+; CD25+)

- Для определения количества HLA-DR экспрессивных лейкоцитов (CD3+HLA-DR+; CD3-HLA-DR+)

-Определение Т-лимфоцитов CD4+CD8+ «дубль» позитивных Т-лимфоцитов (Т-памяти и др.).

- Выявление провоспалительных (CD14+CD16-) и воспалительных моноцитов (CD14+CD16+)

- При определении параметров активности гранулоцитов (фагоцитоз).

Новый портативный и стабильный аппарат PARTEC дает возможность диагностики за короткий срок.

Точный показатель количества лейкоцитов Соunter, определяет процентное количество СD4+Т-лимфоцитов.

Рисунок 70. CYFLOW® COUNTER проточный портативный аппарат

Рисунок.71 Определение абсолютной концентрации СД4 + Тлимфоцитов крови.

Определение количества СД4 + Т лимфоцитов в крови