11. Дифференциальные методы окраски. Окраска по Граму. Этапы приготовления микропрепарата. Примеры грамположительных и грамотрицательных бактерий.
1 Этап.
Взять предметное стекло и обжечь в пламени горелки
Восковым карандашом отметить пределы будущего мазка диаметр 1-2 см
Кладем предметное стекло на рельсы
Прокаленной петлёй наносят в середину кружка небольшую каплю стерильного
изотонического раствора хлорида натрия (ИХН)
Затем в эту каплю вносят небольшое количество культуры бактерий тщательно эмульгируют и распределяют тонким слоем в пределах кружка. Мазки из бульонных культур готовят без предварительного нанесения ИХН
2 Этап. Высушивание.
Стекло оставляют на воздухе до исчезновения влаги или держа высоко под пламенем горелки.
3 Этап. Фиксация.
Фиксацию проводят для того, чтобы:
-убить микробы
-прикрепить их к стеклу
- повысить их восприимчивость к красителям
Для фиксации предметное стекло (мазком вверх) трижды накладывают на пламя горелки на 2-3 секунды с интервалом 4-6 секунд.
Применяют также же различные жидкие фиксаторы, оказывающие более щадящее действие, например:
этиловый или метиловый спирт, ацетон, формалин и др.
Существуют также жидкие фиксаторы, представляющие смесь нескольких веществ например, по Никифорову (смесь этилового спирта и эфира 1:1). Выбор способа фиксации зависит от окрашиваемого объекта и метода окраски: в жидких фиксаторах фиксируют мазки и крови, мокроты, гноя и тп.
Такая фиксация позволяет избежать грубых деформаций объекта исследования.
Окраска по Граму
Красят генцианвиолетом 2 минуты через фильтровальную бумагу
Сливают краску с препарата
Наливают раствор люголя на 1 минуту
Сливают реактив
Обесцвечивают препарат
Промывают препарат водой
погружают в 96% спиртовой раствор йода
Окрашивают разведенным фуксином минуту
Промывают водой
Высушивают препарат фильтровальной бумагой
Микроскопируют
Этот метод позволяет все микроорганизмы разделить на две группы грамположительные (Гр+) и грамотрицательные (Гр–).
Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный.
Сущность окраски по Граму состоит в том, что отношение к краскам зависит от химического состава клетки и структурных особенностей клеточной стенки.
В составе клеточной стенки грамположительных микроорганизмов большое количество пептидогликана в поверхностном слое грамположительных , воздействие этиловым спиртом вызывает его разбухание ,что приводит к уменьшению диаметра пор и снижению проницаемости клеточной стенки.
Краситель не вымывается и микробная клетка не обесцвечивается.
Кроме того микроорганизмов находиться магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, которая в присутствии йода в кислой среде образует прочное соединение с основными красителями.
В клеточной стенке грамотрицательных микроорганизмов пептидогликановый слой меньше, диаметр пор больше и спирт легко проходит через клеточную стенку, вымывая краситель. Микробная клетка принимает цвет дополнительного красителя (красный).
Окраска по Грамму: слева - ГрамОтрицательные, справа - ГрамПоложительные.