Преимущества пцр перед другими методами клинической лабораторной диагностики

Многие традиционные методы диагностики, например, иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что лишь опосредованно свидетельствует о наличии инфекции. При этом выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции. У метода ПЦР существует ряд особенностей, большинство из которых являются несомненными достоинствами этого метода.

Универсальность процедуры выявления различных возбудителей

Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это обусловливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов и дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы, кроме того, в качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические образцы. Наконец, вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) для его проведения используется стандартный комплект приборов.

Специфичность

Важное свойство ПЦР – ее высокая специфичность. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от иммунологических методов анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

Выделяют аналитическую и диагностическую специфичность. Диагностическая специфичность – число отрицательных реакций при тестировании материала образцов от больных контрольной группы (лица с подтвержденным отсутствием инфекции). Аналитическая специфичность оценивается по числу совпадений результатов с референс тест-системой, предоставляемой ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Чем специфичнее данный метод исследования, тем реже он дает "ложно-положительные" результаты. Ложноположительные результаты исследования могут привести к неправильному диагнозу и назначению ненужных и, возможно, ухудшающих качество жизни пациента диагностических и лечебных процедур.

Чувствительность

ПЦР отличается чрезвычайно высокой чувствительностью. Теоретически для осуществления реакции достаточно всего одной копии искомой ДНК (РНК) - последовательности в исследуемом материале.

Аналитическая чувствительность набора - это предел измерения данного ПЦР-диагностикума. Определяется в копиях ДНК или РНК на мл биологической пробы или в геномных эквивалентах ГЭ/мл. Диагностическая чувствительность – число положительных реакций при тестировании образцов от больных опытной группы с подтвержденным диагнозом.

Метод ПЦР позволяет выявлять единичные клетки бактерий или вирусов. Аналитическая чувствительность ПЦР-анализа составляет 1–100 клеток в пробе, в то время как чувствительность иммунологических и микроскопических тестов – 10³–10⁵ клеток. Это позволяет использовать ПЦР, когда серологические и бактериологические исследования не дают положительного результата вследствие крайне низкого микробного титра, например, при количественной (концентрация) оценке содержания НК в биологической пробе, при контроле инфекционной безопасности донорской крови и органов, диагностике хронических и латентных инфекций.

Некоторые тест-системы допускают осуществление одновременного определения нескольких инфекций в одной реакции амплификации, если для определяемых инфекций совпадают программы проведения реакции. Следует отметить, что в этом случае чувствительность реакции уменьшается пропорционально разбавлению. Поэтому рекомендуется одновременно определять не более трех инфекций за одну реакцию.

Чувствительность методов исследования приобретает особенно большое значение в случаях, когда требуется исключить наличие особо опасного инфекционного заболевания. Чем чувствительнее данный метод исследования, тем реже он дает "ложноотрицательные" результаты. Ложноотрицательными называют результаты, не позволяющие выявить имеющееся у пациентов заболевание.

Сравнительная оценка диагностической чувствительности различных методов, проведенная в нескольких зарубежных исследовательских центрах, показала, что экспресс-тесты имеют чувствительность 40–60 %, ИФА – 50–70 %, прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) – 55–75 %, культуральное исследование – 60–80 %, а ПЦР – 90–100 %.