Пробоподготовка (выделение днк/рнк)

До начала работы необходимо подготовить пробы для выделения из них ДНК. Для этого сыворотку и плазму крови, мочу, синовиальную и спинномозговую жидкости, мазки и соскобы (доставленные в транспортной среде) концентрируют, мокроту разжижают, биопсийный и аутопсийный материалы аккуратно измельчают.

Процедура подготовки образца (ДНК, РНК) включает очистку образца от форменных элементов, лизис микроба, экстракцию (извлечение) ДНК из биопрепарата и удаление или нейтрализацию посторонних примесей, способных оказать ингибирующее действие на процесс реакции амплификации. Высочайшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроба или с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. Комплект реагентов для выделения НК должен обеспечивать эффективность экстракции ДНК/РНК (не менее чем 80–95 %) и высокую эффективность амплификации ДНК (в 100000 — 1000000 раз).

Существует два подхода при обработке проб: сложный и простой (табл. 2).

Таблица 2

Основные отличия методов выделения ДНК

Простые	Сложные
Высокие требования к забору материала	Упрощенные требования к забору клинического материала
Быстрое исполнение	Более трудоемкое
Низкая эффективность выделения ДНК	Высокая эффективность выделения ДНК/РНК
Низкая эффективность очистки от ингибиторов	Высокая эффективность удаления ингибиторов
	Возможность автоматизации

Сложный – используют с «грязными» пробами: с гемолизом и/или слизью, дебрисом и т.д. Метод направлен на выделение из образца чистых нуклеиновых кислот за счет их избирательной сорбции. Такая очистка ДНК достигается на специальных микроколонках или с помощью сорбентов, приготовленных на основе силикагеля. Выделение ДНК с помощью сорбентного метода является наиболее оптимизированной и технологичной процедурой пробоподготовки и позволяет увеличить чувствительность метода, что влечет за собой увеличение числа выявления возбудителей инфекций, присутствующих в биологических пробах в минимальных количествах.

Простой – используют при работе с «чистыми» пробами, т.е. без гемолиза, слизи, дебриса и т.д. Метод подготовки проб состоит в простом лизисе исследуемого материала в сочетании с температурной обработкой. При его использовании формируется определенный процент ложноотрицательных результатов, что объясняется неполной экстракцией ДНК и присутствием ингибиторов реакции в пробе.

Существуют следующие подходы очистки нуклеиновых кислот.

1. Использование детергентов для разрушения клеточных стенок и вирусных оболочек, растворения или связывания ингибиторов ПЦР (слизи, белков и др.).

2. Адсорбция органических соединений и тяжелых металлов, присутствующих в крови и других клинических материалах больного, путем добавления в лизирующие растворы смол.

3. Необратимая инактивация белков путем денатурации (протеазы, кипячение, хаотропные агенты).

4. Высаливание ДНК из водного раствора в присутствии этанола (70 %), изопропанола (50 %), (1 мкг ДНК из 50 мкл водного раствора).

5. Использование для разделения фаз вода-фенол. При этом ДНК/РНК остается в водной фазе, а белки переходят в фенольную фазу.

6. Способность ДНК/РНК связываться с частицами силикагеля. Универсальный состав сорбента позволяет связывать максимальное количество ДНК и РНК широкого спектра молекулярных масс, гарантируя получение не менее 80 % высокоактивной тотальной ДНК.

Для подготовки пробы к постановке ПЦР используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Выбор конкретной методики особенно важен при анализе клеточного осадка мочи или гнойного отделяемого, так как эти образцы содержат большое количество субстанций, способных ингибировать ход реакции полимеризации ДНК-мишени.

Стандартным и ставшим уже классическим считается сорбентный метод получения чистого препарата ДНК/РНК. Сорбентный метод выделения ДНК/РНК в различных модификациях является наиболее предпочтительным для ПЦР-диагностики. Его преимуществом является возможность длительного хранения проб в замороженном состоянии, поскольку ДНК сорбируется на носителе и оттаивание проб не оказывает особого влияния на ДНК/РНК. Метод удобен, технологичен, является наиболее оптимизированной процедурой пробоподготовки, при которой достигается хорошая очистка ДНК. Этот метод позволяет увеличить диагностическую чувствительность и количество выявлений возбудителей инфекций, присутствующих в биологических пробах в минимальных количествах.

На этапе экстракции ДНК/РНК важно обеспечить получение максимального количества высокоочищенной нуклеиновой кислоты. Показателями эффективности экстракции являются минимальные потери ДНК/РНК в процессе экстракции, максимальное удаление ингибиторов и нейтрализации нуклеаз, низкий риск перекрестной контаминации «от образца к образцу».

Для оценки эффективности экстракции комплект реагентов для выделения НК должен содержать внутренний контрольный образец (ВКО), который вносится в пробу на этапе экстракции ДНК/РНК и обеспечивает контроль качества проведения всех этапов анализа.