Приборное обеспечение
ПЦР проводят в амплификаторе – приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, с точностью не менее 0,1 °C, который имеет совершенные характеристики переходных температурных процессов, увеличенный ресурс работы и обеспечивает значительное сокращение времени протекания реакции. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта» и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Характерной чертой современных амплификаторов является возможность поддержки пробирочного, планшетного и других форматов амплификации в одном приборе.
Амплификация проводится по заданной программе, соответствующей виду определяемой инфекции и занимает от 2 до 3 часов.
Приборы оснащены программами, контролирующими аналитический процесс, поэтому количество лабораторных ошибок во время анализа минимально, а средства контроля качества наиболее развиты и реально применяются в практике ПЦР-лабораторий.
Регистрация результатов
Амплифицированный фрагмент ДНК выявляют методом электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивый комплекс: он внедряется в «стопку» остатков азотистых оснований ДНК, составляющую сердцевину двойной спирали. В результате они оказываются в гидрофобном окружении, в котором бромистый этидий начинает флуоресцировать. В водной среде он этим свойством не обладает. Поэтому ДНК выявляется в виде светящихся полос при облучении геля УФ светом с длиной волны 290–330 нм. В зависимости от размера образующихся в результате ПЦР-ампликонов используют гель с содержанием агарозы от 1,5 % до 2,5 %. Для приготовления агарозного геля расплавляют в СВЧ-печи или на водяной бане смесь агарозы, буфера и воды, добавляют раствор бромистого этидия. Охлажденную до 50–60 оС смесь заливают в форму слоем толщиной 4–6 мм и с помощью специальных гребенок делают в геле карманы для нанесения образца. Гребенки устанавливают таким образом, чтобы между дном лунок и основанием геля оставался слой агарозы 0,5–1 мм. После застывания геля в карманы наносится амплификат в количестве 5–10 мкл. Рекомендуется параллельно с контрольными и опытными пробами проводить электрофорез смеси маркеров длин фрагментов ДНК. Обычно такая смесь содержит десять фрагментов ДНК длинной 100, 200, 300 и т.д. пар оснований. Постановка такой пробы позволяет верифицировать длину ампликонов в контрольных и опытных пробах. Гель с нанесенным образцом переносят в камеру для электрофореза (рис. 3), заполненную буфером. Камеру подключают к источнику питания и проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в течение 30–45 мин при напряженности электрического поля 10–15 В/см. При этом фронт красителя, входящего в состав реакционной смеси, должен пройти не менее 3 см.
Рис. 3. Камера для электрофоретических разделений ПЦР-продуктов
в агарозном геле.
Результаты оцениваются по наличию специфических фрагментов ДНК в агарозном геле. Специфичность синтезированного фрагмента ДНК подтверждается по его положению (размерам) относительно положительного ДНК-контроля, полосы которых устанавливаются на том же уровне в геле, что и полосы в образцах с положительным контрольным препаратом ДНК, видимых в агарозном геле в присутствии бромида этидия при УФ облучении.
После окончания электрофореза гель переносят на стекло трансиллюминатора и просматривают в ультрафиолетовом свете (рис. 4) и документируют.
В электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю, должна присутствовать оранжевая светящаяся полоса. Ее электрофоретическая подвижность должна соответствовать длине ампликона, указанной в инструкции.
В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю, такая полоса должна отсутствовать. Наличие специфического сигнала в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации – загрязнении используемых реагентов исследуемой ДНК или ампликоном.
Рис. 4. Свечение продуктов ПЦР-реакции в ультрафиолетовом свете.
В последнее время особенно много внимания уделяется модификации и модернизации методов регистрации результатов ПЦР. В целом можно выделить следующие принципиальные направления:
Внедрение систем, регистрирующих и анализирующих изображение геля в цифровом формате.
Гибридизационные методы регистрации результатов. В основе этих методов лежит гибридизация амплифицированной ДНК со специфичным к определяемой последовательности меченым олигонуклеотидным зондом и последующая детекция двуцепочечных ДНК. Применение гибридизационной схемы в детекции амплифицированной ДНК позволяет существенно повысить специфичность анализа, а плашечный формат выполнения делает возможным максимальную стандартизацию и автоматизацию процесса, что практически исключает субъективность оценки. Переход медицинских пользователей к гибридизационному формату регистрации будет во многом способствовать и дальнейшему внедрению диагностических систем нового поколения (рис. 5).
В основе технологии ПЦР в реальном времени лежит принцип флюоресцентной детекции продуктов ПЦР во время амплификации. Такая технология дает возможность осуществлять регистрацию непосредственно в реакционной пробирке, что исключает попадание продуктов реакции в окружающую среду и контаминацию лаборатории. Детектор амплификаторов может одновременно фиксировать свет от шести флюорофоров в 96 лунках и разделять сигналы от разных красителей. Это позволяет вести наблюдение за шестью амплификациями одновременно в каждой лунке одного планшета.
Рис. 5. График регистрации результатов ПЦР в режиме реального
времени (Quantitative real-time PCR).