Введение

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – молекулярно-биологический метод исследования, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой фрагмент ДНК, содержащий специфическую генетическую информацию любого организма среди огромного количества другой ДНК и многократно размножить искомый фрагмент в случае, если он действительно присутствует в исследуемом материале. При ПЦР-диагностике размножению подвергается не бактерия, а только ее ДНК, причем не вся молекула ДНК, а только строго специфическая нуклеотидная последовательность, имеющаяся лишь у данного возбудителя.

В начале 70-х годов норвежским ученым К. Клеппе (Kjell Kleppe) из лаборатории Нобелевского лауреата Х.-Г. Кораны (Har Gobind Khorana) впервые были описаны основные принципы амплификации ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК-синтетических праймеров. Однако в то время эта идея осталась невостребованной, так как ёще не была продемонстрирована основная черта ПЦР - экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК. Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 г. К. Мюллисом (Kary Mullis). За разработку ПЦР-метода он был удостоен Нобелевской премии в области химии в 1993 г.

Открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 30 лет и позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень. За короткое время ПЦР-анализ распространился по всему миру, быстро выйдя из лабораторий научных институтов в сферу практического клинического использования. Этот метод нашел применение в:

• диагностике инфекционных заболеваний, в том числе вызванных агентами, трудно поддающимися культивированию:

• в клинической диагностике вирусных и бактериальных инфекций; диагностике наследственных (муковисцидоз, фенилкетонурия, гемофилия), онкологических и др. заболеваний;

• HLA–типировании;

• гражданской (определение родства) и судебной медицине (идентификация личности);

• генотипировании микроорганизмов, оценке их вирулентности;

• определении устойчивости микрофлоры к антибиотикам;

• пренатальной диагностике;

• биологическом контроле препаратов крови.

Кроме того, молекулярные методы используются в таких областях, как эпидемиология, фармакология, экология, сельское хозяйство, пищевая промышленность, биотехнология.

Изящность, простота исполнения, непревзойденные показатели чувствительности и специфичности принесли новому методу небывалую популярность.

История открытия и разработка метода пцр

Молекулярная биология началась с эры ДНК. ДНК была провозглашена "главной молекулой жизни", "нитью жизни", началом начал и основой всего живого. Белки, ранее рассматриваемые как основной компонент живых систем, теперь "увольнялись" со всех руководящих позиций и "назначались" на второстепенные роли катализаторов, обслуживающих существование ДНК. Роль другого типа нуклеиновых кислот - РНК - сводилась к функции посредников, производимых на матрицах ДНК и направляющих синтез белков. Схема "ДНК—>РНК —> белок" с необратимостью процессов передачи информации, обозначаемых стрелками, получила название "центральной догмы молекулярной биологии".

Появление ПЦР было обусловлено определенными достижениями молекулярной генетики. В 1953 г. Френсис Крик и Джеймс Уотсон открыли структуру двойной спирали ДНК. Эта их работа впоследствии была отмечена Нобелевской премией. Еще одной предпосылкой к появлению нового метода явилась расшифровка нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов. ПЦР стала действительно недорогой и технологичной методикой в результате использования ДНК-полимеразы, выделенной из термофильной бактерии Thermus aquaticus, обитающей в трубопроводах горячей воды. Особенность этой полимеразы заключается в ее исключительной термостойкости, она выдерживает нагревание до температуры кипения без потери активности, а также в высокой рабочей температуре этого фермента (оптимум работы +72 °С).

Универсальным носителем генетической информации и наследственных признаков у всех существующих на Земле организмов является дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Исключение составляют только некоторые микроорганизмы, например, вирусы, носителем генетической информации у которых является РНК – одноцепочечная рибонуклеиновая кислота. Хотя по своему химическому строению РНК несколько отличается от ДНК, она, тем не менее, выполняет у этих вирусов роль, аналогичную роли ДНК (табл. 1).

ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из последовательности химически связанных нуклеотидов. Каждый нуклеотид (дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ и дУТФ в РНК) содержит гетероциклическое кольцо из атомов углерода и азота (азотистое основание), пятиуглеродное сахарное кольцо (пентозу) и фосфатную группу. Две полинуклеотидные цепи в ДНК соединяются двумя или тремя водородными связями, возникающими между азотистыми основаниями.

Таблица 1

Основные различия между ДНК и РНК

ДНК	РНК
Хранение генетической информации	Передача генетической информации
Стабильный компонент клетки	Нестабильный короткоживущий компонент клетки
Содержит генетическую информацию	Участвует в синтезе белка

В основу модели ДНК легли ее свойства:

• комплементарность, когда в двойной спирали две полимерные цепи ДНК связаны бок о бок водородными связями за счет образования пар Г–Ц, Ц–Г, А–Т и Т–А;

• антипараллельность комплементарных цепей – две полинуклеотидные цепи идут в противоположных направлениях: 5’-конец одной нити соответствует 3’-концу второй нити.

Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться. В живой клетке этот процесс происходит следующим образом: с помощью специальных ферментов – гираз – происходит раскручивание спирали в том ее участке, где должна происходить репликация. Далее водородные связи, связывающие нити, разрываются и нити расходятся. Одна из цепей (“+”) используется в качестве основной матрицы. Построение новой нити ДНК идет только в одном направлении - от 5'-конца к 3'-концу. Этот процесс осуществляется по принципу комплементарности ферментом ДНК-полимеразой. Для того чтобы фермент начал свою работу, требуется наличие стартового блока – небольшого начального двухцепочечного фрагмента. Стартовый блок образуется при взаимодействии небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК (праймера) с комплементарным участком соответствующей цепи родительской ДНК. Репликация одновременно идет и на второй нити ДНК (“-”), только в этом случае наращивание цепи происходит в обратном направлении. В результате процесса репликации из одной молекулы ДНК образуется две молекулы ДНК, в которых одна нить синтезируется от материнской молекулы ДНК, а вторая – дочерняя, вновь синтезированная.