Клонирование генов
Клонирование генов используется, в частности, для исследования генов, вызывающих наследственные болезни. В результате генно-инженерных манипуляций можно получить большое количество продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать кДНК, которую затем вставляют в вектор – фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК (рис. 8).
Рис. 8. Клонирование гена с использованием плазмиды: (1) – хромосомная ДНК организма A; (2) – ПЦР; (3 ) – множество копий гена организма А;
(4) – вставка гена в плазмиду; (5) – плазмида с геном организма А;
(6) – введение плазмиды в организм В; (7) – умножение количества копий гена организма А в организме В.
Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена – РНК или белка. Таким образом, в промышленных количествах получают многие белки для использования в медицине, сельском хозяйстве и др.
Молекулярное клонирование явилось движущей силой биотехнологической революции. Применение этого метода сделало возможным идентификацию, локализацию и описание генов, создание генетических карт и секвенирование целых геномов, проведение параллелей между генами и характеристиками организма и определение молекулярных основ этих характеристик.
Примерами использования этого подхода является идентификация генов муковисцидоза, болезни Хантингтона и нейрофиброматоза и др.
В последнее время активно развиваются ДНК-технологии, которые позволяют не только определять признак, но и одновременно определять точечные мутации или полиморфизм в известных участках генома, быстро получать разнообразную информацию о геноме, экспрессии и мутациях генов, используя большое количество олигонуклеотидных проб в ДНК-чипе. Эти технологии предоставляют большую информацию исследователям и врачам, что, несомненно, важно для диагностики и лечения заболевания.
Онкология
До недавнего времени диагностика и прогноз в онкологии основывались в основном на оценке косвенных показателей, позволяющих составлять лишь наиболее общую классификацию гистологических и морфологических подтипов. Одновременный анализ экспрессии и характеристика множества генов открывает беспрецедентные возможности формирования молекулярного портрета опухоли, благодаря развитию технологии биологических микрочипов. Микрочипы представляют бесценную информацию о патогенезе заболевания, его прогрессии, восприимчивости к терапии. Получаемый при этом массив информации может стать основой для уточнения классификации опухолей, совершенствования ранней диагностики и разработки инновационных подходов к терапии рака.
Применение пцр в практике службы крови
Проблема вирусной безопасности препаратов донорской крови приобретает особую актуальность в связи с эпидемической ситуацией, сложившейся в отношении вирусных гепатитов и ВИЧ-инфекции. Вероятность вирусной контаминации многих сотен литров плазмы в результате попадания одной или нескольких доз плазмы от доноров в серонегативном периоде становится весьма значительной. Инкубационный период острого гепатита С длится от 6 до 12 и более недель. Время появления anti-HCV различно: в одних случаях – через 2–4 недель после начала гепатита, в других – через месяцы после повышения уровня аминотрансфераз. У ряда больных с самоограничивающимся течением инфекции anti-HCV никогда не появляются, возможно, вследствие низкой концентрации циркулирующих вирусных антигенов. При этом в сыворотке у них выявляется HCV РНК методом ПЦР. У больных с посттрансфузионным отсутствием РНК HCV кратковременное выявление anti-HCV непосредственно после трансфузии может быть обусловлено пассивным переносом anti-HCV от донора. Выявление HCV РНК с помощью ПЦР может подтвердить наличие виремии при отрицательных результатах исследования anti-HCV методом ИФА. HCV РНК появляется в крови гораздо раньше других маркеров, и обнаружить ее можно через несколько дней после инфицирования.
В большинстве развитых европейских стран, с 1997 года в Нидерландах и Австралии, в известной фирме «ИММУНО» введено дополнительное генотестирование всех пулов плазмы и продуктов ее переработки. Все препараты, получаемые из этой плазмы, имеют сертификат «ПЦР-качество». Генотестирование пулов плазмы и продуктов ее переработки проводится не взамен ИФА, а параллельно.
Возможность генотестирования плазмы крови на вирусы не одного донора, а минипула, в котором объединены аликвоты плазмы от нескольких десятков или сотен доноров, доказана многими крупными банками крови Европы. Такое дополнительное генотестирование серонегативной крови в минипулах значительно снижает затраты, ускоряет получение результатов и реально увеличивает вирусную безопасность донорской крови и ее компонентов.
При использовании крови и препаратов из нее для переливания новорожденным, больным СПИДом, лицам с пересаженными органами, получающим иммунодепрессивную терапию, необходим дополнительный контроль донорской крови на вирусы герпеса и цитомегалии. Наиболее эффективным методом анализа крови на присутствие этих возбудителей является метод ПЦР.
Клиническое значение наиболее актуальных ПЦР - исследований, которые выполняются в Иркутском диагностическом центре, а также правила взятия материала для этих исследований более подробно представлены в приложении.