Molekulyarnaya_biotekhnologia_Glik_B__Pasternak_Dzh

тазы после индукции транскрипции добавлением триптона приходится соответственно 21 и 24% от общего количества синтезируемого белка. Таким образом, двухплазмидные системы позволяют получать белковые продукты с помощью реком-бинантных микроорганизмов в промышленных масштабах и относительно недорого.

Использование для экспрессии других микроорганизмов

Е. coll — не единственный микроорганизм, который используется для синтеза чужеродных белков. К сожалению, генетические и молекулярно-биологические свойства большинства других микроорганизмов изучены не так хорошо. Кроме того, нет ни одного вектора или даже промо-торно-репрессор ной системы, которая обеспечивала бы оптимальный уровень экспрессии в клетках всех или хотя бы только грамотрицательных бактерий. К счастью, многие стратегии, разработанные для Е. coli, пригодны и для множества других микроорганизмов, что позволило проверить различные промоторы на их способность обеспечивать транскрипцию в других гра-мотрицательных бактериях. Так, в одном из исследований был сконструирован набор плазмидных экспрессирующих векторов, содержащих промоторы lас, tac, Nm (гена устойчивости к неомицину) и SI (гена рибосомного белка S1 Rhisobium meliloti), и определен уровень экспрессии гена ß-лактамазы под контролем каждого из них (табл. 6.2). Обнаружилось, что: 1) указанные промоторы проявляют ту или иную активность во всех использованных бактериальных системах; 2) промотор tac наиболее активен в Е. coli и гораздо менее — в других бактериях; 3) Nm — второй по активности промотор в E. coli и самый активный в других бактериях. Промоторные участки у всех грамотрицательных бактерий имеют сходную нуклеотидную последовательность, однако это не означает, что самым эффективным промотором для того или иного организма будет тот, который наиболее эффективен в Е. coli. Тем не менее Е. соli- промоторы могут оказаться вполне приемлемыми для регуляции экспрессии клонированных генов и в других грамотрицательных бактериях.

Попытки создания «универсального» экспрессирующего вектора для грамотрицательных бактерий были весьма многочисленными. В конце концов была выбрана следующая стратегия. Фрагмент ДНК размером 70 п. н., происходящий от одного из концевых инвертированных повторов в транспозоне 5 (Tn5), встроили вместе с соответствующим промотором в полилинкер малокопийной плазмиды pRK290 с широким спектром хозяев и получили плазмиду pAV10 (рис. 6.5). Клонированный сегмент ДНК из Tn5 содержал два независимых, но перекрывающихся промотора, каждый из которых необходим для транскрипции одного из ключевых Tn5-генов. Поскольку Tn5 эффективно экспрессируется в разных бактериях, его промоторы можно использовать для транскрипции различных генов. Чтобы проверить это, в полилинкер сразу за клонированными промоторами Тn5 встроили гены хлорамфеникол-ацетил-трансферазы и ß-галактозидазы. Их эффективная экспрессия происходила в клетках Alcaligenes sp,, E. coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas stuizeti, Pseudomonas fluorescens и Serratia marcescens. Таким образом, есть реаль-

Таблица 6.2. Активность ß-галактозидазы в грамотрицательных бактериях, несущих плазмидный вектор с геном lacZ E.coli и гетерологичным промотором1)

Промотор Активность ß-галактозидазы, ЕД

1) По данным Labes et al., 1990, Gene 89: 37—46.

Рис. 6.5. Клонируюший вектор pAV10 (без соблюдения масштаба). Показано положение гена устойчивости к тетрациклину (Tetr), сайта рестрикции для эндонуклеазы BglII, сайта инициации репликации (on), промотора (p) и полилинкера (ПЛ). Встраивание клонированного гена в полилинкер ставит его под контроль промотора Тn5 (р). Стрелка указывает направление транскрипции.

ная возможность использовать Тn5-промоторы для инициации транскрипции чужеродных генов в клетках различных бактерий.

Химерные белки

Очень часто чужеродные белки, особенно небольшие, обнаруживаются в гетерологичных хозяйских клетках лишь в минимальных количествах. Такой кажущийся низкий уровень экспрессии кодирующих их генов во многих случаях объясняется деградацией чужеродных белков в хозяйских клетках. Один из способов решения этой проблемы состоит в ковалентном присоединении продукта клонированного гена к какомунибудь стабильному белку клетки-хозяина. В составе подобной конструкции, получившей название «химерный белок», продукт клонированного гена оказывается защищенным от расщепления протеазами хозяйской клетки, что было показано в ходе экспериментов.

Слияние белков программируется на уровне ДНК лигированием кодирующих участков соответствующих генов. В самом простом виде векторная система слияния предусматривает включение гена-мишени или его сегмента в кодирующий участок клонированного генахозяина. Очень важно, чтобы РНК. транскрибируемая с клонированного гена-мишени, имела правильную нуклеотидную последовательность, обеспечивающую образование продукта клонированного гена. Если при объединении сегментов ДНК происходит изменение рамки считывания, т. е. последовательность колонов детерминирует укороченный или неправильный трансляционный продукт, то не сможет образоваться и функционально активная форма белка. Убедиться в правильности рамки считывания можно разными способами. Как правило, для этого необходимо знать точную нуклеотидную последовательность лигируемых фрагментов ДНК,

Расщепление химерных белков

В зависимости от предназначения белкового продукта клонированного гена он может использоваться как таковой или в составе химерного белка, причем последний вариант встречается нечасто. Например, из-за присутствия фрагмента хозяйского белка большинство химерных белков оказываются непригодными для применения в клинике, а сам продукт клонированного гена-мишени может оказаться неактивным. Кроме того, для химерных белков предусмотрена более сложная процедура тестирования, которую они должны пройти, чтобы получить разрешение к применению у соответствующих организаций. Все это заставляет искать способы удаления лишних аминокислотных последовательностей из молекулы получаемого продукта. Один из таких способов основан на присоединении белка, кодируемого геном-мишенью, к белку клетки-хозяина, содержащему короткий пептид, распознаваемый специфической протеазой небактериального происхождения. Такое присоединение тоже программируется на уровне ДНК. Олигонуклеотидные линкеры, несущие сайты для протеаз. можно пришить к клонированному гену до того, как такая конструкция будет введена в экспрессирующую векторную систему слияния. Линкером может служить, например, олигонуклеотид, кодирующий пептид Ile-Glu-Gly-Arg. После синтеза и очистки химерного белка для отделения белкового продукта, кодируемого клонированным геном, можно использовать фактор свертывания крови Ха, который является специфической протеиназой, разрывающей пептидные связи исключительно на С-конце последовательности Ile-Glu-Gly-Arg (рис. 6,6). Более того, поскольку такой пептид

Рис. 6.6. Протеолитическое расщепление химерного белка фактором свертывания крови Ха. Фактор Ха узнает аминокислотную последовательность, разделяющую два компонента химерного белка. После расщепления высвобождается функциональный белок, кодируемый клонированным геном.

встречается в природных белках довольно редко, этот подход можно использовать для отделения многих других продуктов, кодируемых клонированными генами.

Применение химерных белков

В некоторых случаях конечным продуктом, который предполагается использовать, является сам химерный белок. Например, нередко возникает необходимость в получении антител, узнающих конкретный участок белковой молекулы. Чтобы решить эту задачу, можно встроить в подходящий вектор сегмент ДНК, кодирующий белковый домен, к которому будут вырабатываться нужные антитела. Образующийся в результате химерный белок и будет служить антигеном. Антитела к стабилизирующему его белковому компоненту, происходящему от хозяйской клетки, можно удалить абсорбцией их на чистом стабилизирующем белке, и тогда останутся только антитела, связывающиеся с нужной аминокислотной последовательностью.

Один из клонирующих векторов системы слияния, сконструированных для получения специфических антител, содержит 5'-концевой сегмент гена ompF E. coli, кодирующего один из наружных мембранных белков, и прилегающую к нему часть гена lacZ (ß-галактозидазы) E. coli (рис. 6.7). Этот сегмент содержит информацию, необходимую для инициации транскрипции и трансляции химерного гена, а также для секреции химерного белка. Несмотря на то что укороченный ген lacZ, лишен кодонов для первых восьми аминокислот, кодируемый им белок сохраняет ферментативную активность. В такой форме ß- галактозидаза способна функционировать независимо от того, какие пептиды присоединены к ее N-концу. Ген lacZ встроен в вектор таким образом, что он попадает «не в ногу» с рамкой считывания лидерной последовательности ompF, поэтому активная ß-галактозидаза не образуется. Однако если рамка считывания какого-либо клонированного фрагмента ДНК согласуется с таковой для генов ompF и LacZ, то образуется трех компонентны и химерный белок, состоящий из OmpF-фрагмента, белка, кодиру-

Рис. 6.7. Клонирующий вектор системы слияния. Он содержит ген устойчивости к ампициллину (Атрг) в качестве селективного маркера, 5 '-концевой сегмент гена ompF, колирующий N-конец наружного мембранного белка, сайт для рестрицирующей эндонуклеазы AbcI и укороченный ген ß-галактозидазы (lacZ). Ген, который хотят клонировать, встраивают в АbcI-сайт. После транскрипции и трансляции этой генетической конструкции образуется трехкомпонентный химерный белок.

Таблица 6.3. Очистка химерных белков, продуцируемых Е. соli1'

1)По данным работы Nygren et al., 1994, Tnnds Biolecfutol, 12: 184-188,

2)ZZ - фрагмент белка A Staptyjaaxcus aufeus, Strep-lag - пептид, обладающий сродством к стрептавидину; PinPoint - белковый фрагмент, биотинилированный в Е, coli In vivo; MBP — мальтозосвязываюший белок; GST — глутатион S-трансфераза; Flag — пептид, узнаваемый энтерокиназой.

емого клонированным геном, и функционально активной С-концевой части ß- галактозидазы. Он может использоваться как антиген для выработки антител, дающих перекрестную реакцию с белком клонированного гена, или как инструмент для получения небольших фрагментов специфических белков.

Химерные белки используются не только для стабилизации полипептидов, но и для упрощения процедуры очистки рекомбинантных белков (табл. 6.3). Так, плазмидная конструкция Saccharomyces cerevisiae, содержащая ген человеческого интерлейкина-2 с присоединенным к нему сегментом ДНК, кодирующим маркерный пептид Asp-Туг- Lys- Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (он продается под названием Flag), выполняет двоякую функцию: обеспечивает стабилизацию продукта гена интерлейкина-2 и облегчает его очистку. Интерлейкин-2 — это биологический фактор, стимулирующий рост Т-клеток и синтез В-клеточных антител. Химерный белок, образующийся после экспрессии этой генетической конструкции в дрожжевых клетках, может быть очищен за один прием с помощью иммуноаффинной хроматографии. Для этого моноклональные антитела к маркерному пептиду фиксируют на полипропиленовом носителе и пропускают через колонку химерный белок, который связывается с этими антителами (рис. 6.8). Маркерный пептид — небольшая молекула, на его образование расходуется лишь малая часть клеточных ресурсов. Химерный белок обладает такой же биологической активностью, что и нативный интерлейкин-2. Однако если он предназначен для применения в клинике, то маркерный пептид необходимо удалить. Таковы требования государственных служб, контролирующих использование фармацевтических препаратов. Для этого можно использовать бычью энтерокиназу.

Многие белки, продуцируемые Е. соli, накапливаются в клетках в форме нерастворимых биологически неактивных телец включения. И хотя из таких структур часто удается получать в небольших количествах биологически активный белок, для этого приходится проводить продолжительную солюбилизацию. Плохая растворимость белков in vivo часто обусловливается их неправильной укладкой, и эту проблему пытались решить различными способами. Так, известно, что химерные белки, одним из компонентов которых является тиоредоксин, белок мол, массой 11,7 кДА, остаются в растворе, даже если на их долю приходится 40% суммарного клеточного белка. Имея это в виду, ген-мишень встроили в полилинкер сразу вслед за геном тиоредоксина, так чтобы оба этих гена попали под контроль pL-npoмотора в плазмидном векторе E. соli (рис. 6.9). В хромосоме хозяйских клеток E. соli, использующихся в этой системе, присутствует генетическая конструкция, детерминирующая образование репрессора cI

— копия гена cI, находящаяся под транскрипционным контро-

1. Смесь секретированных белков

4. Элюирование химерного белка

2. Подготовка колонки для иммуноаффинной хроматографии

лем промотора trp. В отсутствие триптофана (рис. 6.9, А) репрессор образуется в количестве, достаточном для блокирования транскрипции с pL-промотора, и химерный белок не синтезируется. Когда в среду добавляют триптофан (рис. 6.9, Б), trp- промотор выключается и белок-репрессор не синтезируется, а гены химерного белка транскрибируются с плазмидного pL-промотора. Синтезируемый химерный белок, состоящий из тио-редоксина и белка-мишени, концентрируется в основном в особых областях с внутренней стороны плазматической мембраны Е. соli, называемых зонами адгезии, и высвобождается из клеток при осмотическом шоке. Далее белок-мишень можно отщепить от химерного белка с помощью энтерокиназы. Химерный белок, содержащий тиоредоксин, можно очистить еще одним способом. Если белок-мишень остается стабильным лри повышении температуры, то, поскольку тиоредоксин не разрушается при нагревании вплоть до 80 °С, химерный белок можно инкубировать при высоких температурах и освободиться от большинства других клеточных белков, разрушающихся при этих условиях.

Включение белков в поверхностные структуры

Для скрининга обширных (до 5-1010 клонов) библиотек комплементарных ДНК (кДНК), кодирующих редко встречающиеся белки, были разработаны специальные системы слияния. Обьгчно кДНК встраивают в гены поверхностных белков (белков филаментов или пилей) нитчатых бактериофагов (например, М13) или бактерий и после транскрипции и трансляции получают химерные белки, входящие в состав поверхностных структур этих микроорганизмов. Здесь их идентифицируют иммунологическими методами. Часто для слияния используют ген поверхностного белка pIII фага М13, который связывается с F- пилями Е. coli и инициирует инфекцию. Для клонирования кДНК и других

Рис. 6.9. Экспрессия плазмидного вектора с генетической конструкцией «ген тиоредоксина— ген белка-мишени» в отсутствие (А) и в присутствии (Б)

триптофана. Стрелки, помеченные рТrp и pL-,

указывают направление

транскрипции. Сокращения и обозначения: oТгр

оператор, с которым связывается репрессор tip: о1 - оператор, с которым связывается репрессор cI; pΤrp - trp-промотор, pL - левый промотор бактериофага λ; ТТ - сигнал терминации транскрипции. Между генами тиоредексина и белкамишени находится нуклеотидная последовательность, которая кодирует пептид, расщепляемый энтерокиназой. Подковообразными кривыми изображено связывание репрессоров с соответствующими операторами.

кодирующих последовательностей была сконструирована плазмида (фагмида), содержащая небольшой фрагмент ДНК M13, который обеспечивал ее упаковку in vitro в фаговые частицы. ген белка pIII под контролем какого-нибудь регулируемого бактериального промотора (например, lac-промотора Е. coli) и сайт клонирования вблизи 5'- конца гена рIII. После репликации рекомбинантного фага М13 в E. coli белок-мишень оказывался сшитым с N-концом фагового белка, и содержащие его бляшки можно было идентифицировать иммунологическими методами. Рекомбинантные фагмиды, выделенные из таких бляшек, могут служить источником соответствующей кДНК. Эта весьма эффективная селективная система позволяет обнаруживать кДНК редких, но очень важных белков.

Библиотеки, содержащие гены поверхностных бактериальных белков, можно использовать и для идентификации клонов, несущих специфические нуклеотидные последовательности. Чтобы включить искомый белок в поверхностные структуры грамотрицательной бактерии, например E. coli, сшивают его гены и гены белков этой структуры. В качестве бактериальных белков используются белок наружной мембраны А (ОгпрА) и пептидом и кансвязан-ный липопротеин (PAL) E. coli, а также белок F наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa (OprF). При этом белок-мишень обычно находится либо на С-, либо на N-конце химерного белка, но иногда короткие полипептиды включаются в середину молекулы бактериального белка (рис. 6.10).

Рис. 6.10. Химерные белки, состоящие из поверхностного бактериального белка и чужеродного белка-мишени, присоединенного к его N- или С-концу (А) либо включенного в экспонируемые участки молекулы (Б). В обоих случаях чужеродные пептиды или белок оказываются на поверхности бактериальной клетки.

Системы слияния с локализацией белков-мишеней на поверхности бактериальных клеток можно использовать также для суперпродукции некоторых белков и пептидов. Так, в одной из работ в участок, кодирующий основной белок наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa (OprF), был встроен ген антигенного детерминанта возбудителя малярии Plasmodiutn falciраrит. Бактериальные клетки, синтезирующие соответствующий химерный белок, давали положительную реакцию с моноклональными антителами к P.falciparum. Следовательно, поверхностные химерные белки можно использовать в качестве вакцин (гл.

11).

Однонаправленное тандемное расположение генов

Обычно уровень генной экспрессии пропорционален числу копий транскрибируемого гена в хозяйских клетках. Отсюда следует, что с увеличением числа копий плазмиды должно увеличиваться и количество продукта встроенного в эту плазмиду гена. Однако помимо клонируемого гена плазмида содержит и другие транскрибируемые последовательности, например гены устойчивости к антибиотикам, и по мере увеличения ее копийности энергетические ресурсы клетки будут во все большей степени направляться на образование белков, кодируемых плазмидой, и метаболическая активность хозяйской клетки упадет. Выходом из этой ситуации могло бы стать встраивание в малокопийную плазмиду нескольких копий интересующего исследователя гена. Однако при этом возникает одна техническая проблема — расположение генов в такой ориентации, чтобы все они могли правильно транскрибироваться и транслироваться. Простое сшивание «конец-в-конец» приводит к случайной ориентации генов, так что одни из них экспрессируются, а другие, находящиеся в противоположной ориентации, — нет (рис. 6.11).

Чтобы решить эту проблему можно использовать рестрицирующий фермент AvaI, который узнает последовательность CTCGGG и разрезает ДНК с 5'-конца от остатка Т. Процедура состоит в следующем. Плазмиду, содержащую эту последовательность, разрезают с помощью AvaI и. используя ДНК-полимеразу I, достраивают липкие концы. Затем к обоим ее тупым концам пристраивают EcoRI-линкер (GAATTC), вновь замыкая кольцо. Получившаяся плазмида содержит сегмент ДНК с двумя AvaI-сайтами, фланкирующими EcoRI-сайт и перекрывающимися с ним (рис. 6.12, А и Б), т. е. последовательность CTCGGG AATTCTCGGG (здесь подчеркнутые основания — сайты узнавания для AvaI). Нужный ген вместе с трансляционными старт-и стоп-сигналами встраивают в EсоRI-сайт и затем вырезают из плазмиды с помощью AvaI (рис. 6.12, В). Такие фрагменты имеют неидентичные липкие концы, и поэтому при последующем сшивании соединяются в одной ориентации. Подобный набор однонаправленных тандемных копий гена может быть встроен в экспрессирую-щий вектор. При этом тандемная последовательность может находиться в двух ориентациях относительно промотора, так что ее экспрессия будет происходить только в 50% случаев.

Рис. 6.11. Образование случайно ориентированных тандемных повторов. А. Клонированные гены вырезают из клонирующего вектора с помощью рестрицируюшей эндонуклеазы АbсI и отделяют от векторной ДНК. Б. Создают условия, при которых происходит сшивание вырезанных генов. Поскольку нуклеотидные последовательности обоих выступающих концов генов одинаковы, последние могут соединяться в любой ориентации. В результате образуются тандемные повторы из случайно ориентированных последовательностей.

Другой подход основан на использовании синтетических ориентированных адаптеров - коротких олигодезоксинуклеотидов, присоединенных к концам линеаризованной плазмидной ДНК и к концам фрагментов ДНК с клонируемым геном. При лигировании эти фрагменты располагаются только в одной ориентации. Описанная процедура технически значительно более проста, чем та, в которой используется ре-стрицирующая эндонуклеаза AvaI; кроме того, она не требует, чтобы в гене-мишени отсутствовали AvaI- и EcoRI-сайты.

Уже показано экспериментально, что уровень экспрессии генов интерферона действительно увеличивается пропорционально числу тандемных копий гена, по крайней мере до четырех копий на плазмиду. Однако тандемные повторы иногда оказываются нестабильными и со временем некоторые из них или даже все утрачиваются плазмидой.

Трансляционные экспрессирующие векторы

Наличие сильного регулируемого промотора -это очень важное, но недостаточное условие максимизации количества продукта клонированного гена. Большую роль играют также эффективность трансляции и стабильность самого продукта. В прокариотических клетках разные мРНК не всегда транслируются с одинаковой эффективностью. Различие может составить несколько сотен раз, и в результате в клетке будут присутствовать сотни или даже тысячи копий одних белковых молекул и лишь несколько копий других.

Различия в трансляции связаны — по крайней мере частично — со свойствами имеющегося в транскрибированной РНК сигнала инициации трансляции, называемого сайтом связывания рибосомы. Сайт связывания рибосомы — это

Рис. 6.12. Клонирование нескольких копий гена в одной плазмиде. А. Создание вектора. Плазмиду разрезают по AvaI-сайту и образовавшиеся липкие концы достраивают с помощью ДНК-полимеразы I E. coli. К тупым концам присоединяют EcoRI-линкер, замыкающий кольцо. Б. Встраивание EcoRI -линкера в AvaΙ-сайт в плазмиде. B. Образование однонаправленного тандемного повтора.

Рис. 6.13. Внутрицепочечное спаривание в молекуле мРНК, препятствующее эффективной трансляции. GGGGG — сайт связывания рибосомы, AUG (красные буквы) - инициаторный кодон, CAG-CAU-GAU-UUA-UUU — несколько первых кодонов. Обратите внимание, что кроме обычных для мРНК пар A-U и G-C иногда образуются пары G-U.

tac- Промотор: функциональный гибрид, полученный из trp- и lac- промоторов

H. A. DeBoer, L J. Comstock, M. Yasser Proc. Nail. Acad. Sa. USA 80: 21-25, 1983

триптофана, ситуация

последовательность из шести-восьми нуклеотидов (например, UAAGGAGG), спаривающаяся с комплементарной последовательностью (в данном случае AUUCCUCC) РНК-компонента (рРНК) малой субъединицы рибосомы. Обычно чем прочнее связывание между мРНК и рРНК, тем выше эффективность инициации трансляции. Именно поэтому большинство экспресси-рующих Е. сoli-векторов конструируют таким образом, чтобы мРНК клонированного гена обязательно содержала сильный сайт связывания рибосомы. Это необходимое условие трансляции гетерологичных про- и эукариотических генов в E. coli. Однако должны соблюдаться и некоторые другие условия. Во-первых, нуклеотидная последовательность, связывающаяся с рРНК, должна находиться на определенном расстоянии от старт-кодона клонированного гена (в РНК старт-кодоном является AUG; в ДНК ему соответствует кодон ATG). Во-вторых, участок ДНК, содержащий сайт связывания рибосомы и несколько первых кодонов клонированного гена, не должен иметь такую нуклеотидную последовательность, при которой после транскрипции может произойти внутрицепочечное спаривание (рис. 6.13), нарушающее связывание мРНК с рибосомой. Именно локальная вторичная структура мРНК, обеспечивающая экранирование или, напротив, экспонирование сайта связывания рибосомы, и определяет прочность связывания мРНК с комплементарной рРНК. Таким образом, при клонировании любого гена важно убедиться в том, что сайт связывания рибосомы расположен на нужном расстоянии от этого гена и что вторичная структура мРНК не помешает его присоединению к рибосоме.

Уже создано большое количество векторных систем, которые включают как транскрипционный, так и трансляционный сигналы, обеспечивающие экспрессию клонированных эукариотических генов в E. coli. Одной из таких систем