Molekulyarnaya_biotekhnologia_Glik_B__Pasternak_Dzh

примерно 400 нуклеотидов, с помощью которого ДНК-зонд связывается с заранее отмеченной точкой на найлоновом фильтре, а остальная его часть остается свободной и может гибридизоваться (рис. 9.12). Сегменты тестируемой ДНК, каждый из которых включает по одному из возможных мутационных сайтов, одновременно амплифицируют с помощью ПЦР, причем один пpaймер из каждой пары на 5'-конце помечен биотипом. Амплифицированные фрагменты ДНК-мишени гибридизуют с зондами, пришитыми к фильтру, в условиях, обеспечивающих гибридизацию только полностью комплементарных последовательностей. В гибридизационную смесь добавляют стрептавидин, связанный с щелочной фосфатазой (можно также использовать пероксидазу хрена или уреазу). После гибридизации промывают фильтр и добавляют неокрашенный субстрат. Если имеет место полное соответствие между амплифицированным сегментом ДНК-мишени и специфическим олигонуклеотидным зондом, то на фильтре появится цветная точка. На один и тот же фильтр можно нанести несколько точек, соответствующих целому ряду разных специфических олигонуклеотидных зондов. Проанализировав эту цветную мозаику, можно идентифицировать один из многих возможных сайтов мутации.

Перспективы

Молекулярная диагностика — это быстро развивающееся направление. Хотя его основные принципы уже сформировались, технические детали отдельных тестов могут различаться. Для получения в достаточном количестве ДНК-мишени сейчас успешно применяют ПЦР. Использование ПЦР и специфических зондов существенно повышает чувствительность тестов и позволяет применять нерадиоактивные хромогенные, хемилюминесцентные и флуоресцентные системы регистрации. Во многих случаях для выявления мутации или экзогенной ДНК инфекционного агента в исследуемом образце достаточно провести ПЦР с последующим электрофоретическим разделением продуктов. Не вызывает сомнения, что с помощью ДНК-диагностики можно будет выявлять большинство, а возможно и все наиболее распространенные генетические и инфекционные заболевания, а также новообразования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Любой эффективный диагностический тест должен быть: 1) высокоспецифичным в отношении молекулы-мишени; 2) достаточно чувствительным для выявления небольших количеств мишени; 3) достаточно простым, позволяющим без труда получать однозначные результаты. Существуют два типа методов молекулярной диагностики: один основан на сродстве антитела к конкретному антигену, другой — на идентификации специфических нуклеотидных последовательностей с помощью гибридизации или ПЦР.

Наиболее распространенным иммунологическим методом является ELISA. Вкратце он состоит в следующем: 1) фиксация образца на твердой подложке; 2) добавление первого антитела, специфичного к антигену-мишени, и его связывание с антигеном-мишенью; 3) добавление конъюгата второе антитело-фермент, который присоединяется к первому антителу; 4) добавление неокрашенного субстрата, который под действием фермента, входящего в состав конъюгата, превращается в окрашенное соединение. Изменение цвета реакционной смеси свидетельствует о присутствии в образце молекулы-мишени.

EL1SA применяется для обнаружения различных белков, идентификации вирусов и бактерий, а также определения низкомолекулярных соединений в широком спектре биологических образцов. Чтобы повысить специфичность первых антител, для диагностики часто используют моноклональные антитела. При этом для уменьшения стоимости прибегают к технике клонирования их фрагментов в Е. coli и получают комбинаторную библиотеку, а на ее основе — широкий спектр комбинаций Fv-фрагментов.

Высокочувствительным и специфичным методом обнаружения нуклеотидных последовательностей в биологических образцах является гибридизация. Его использовали при разработке способов идентификации патогенных микроорганизмов в клинических образцах и различных микроорганизмов в окружающей среде.

ДНК-диагностика основывается на обнаружении известных нуклеотидных последовательностей; для этого синтезируют специфические праймеры и амплифицируют последовательность-мишень. Это позволяет использовать нерадиоактивные системы детекции (например, хемилюминесцентный метод) или регистрировать ПЦР-продукты методом гельэлектрофореза. Кроме того, ПЦР-продукты можно пометить флуоресцентным красителем, присоединив его к 5'-концу праймера.

В судебной медицине все более широкое применение находит метод геномной дактилоскопии, основанный на том, что ДНК каждого человека образует уникальный набор гибридизационных полос. При этом в качестве зондов обычно используют минисателлитные ДНК человека, которые не кодируют никаких белков и отличаются высокой вариабельностью.

Для характеристики ДНК растений используют набор произвольных олигонуклеотидных праймеров, проводят ПЦР-амплифицикацию случайных фрагментов ДНК, осуществляют электрофорез и получают специфичный для каждого растения набор полос ДНК; данный подход носит название RAPD.

Методы ДНК-диагностики применяют также для обнаружения точковых мутаций в данном гене. Один из подходов заключается в лигировании двух олигонуклеотидных праймеров. При несоответствии всего одного нуклеотида в месте стыковки гибридизовавшихся олигонуклеотидов лигирования не происходит.

ЛИТЕРАТУРА

Barany F. 1991. Single-nucleotide genetic disease detection using cloned thermostable ligase.

Proc. 1991 Miami Bio/Technol. Winter Symp. 1:88.

Barker R. H., L, Suebsaeng, W. Rooney, G.C. Alecrim, H. V. Dourado, D. F. With. 1986. Specific DNA probe for the diagnosis of Plasmodium falciparum malaria. Science 231: 1434-1436.

Bugawan T L., R. K. Saiki, С. H. Levenson, R. M. Watson, H. A. Erfich. 1988. The use of nonradioactive oiïgonucleotide probes to analyze enzy-matically amplified DNA for prenatal diagnosis and forensic HIA typing. Bio/Technology 6:943-947.

Carlson D. Р., С. Superko, J. Mackey, M. E. Gaskill, P. Hansen. 1990. Chemilumines-cent detection of nucleic acid hybridization. Focus 12:9-12,

Caskey C. T. 1987. Disease diagnosis by recombinant DNA methods. Science 236: 1223-1229. Chehab F. F., Y. W. Kan. 1989. Detection of specific DNA sequences by fluorescence

amplification: a color complementation assay, Proc. Natl. Acad. Set. USA 86: 9178-9182.

Debenham P. G. 1992. Probing identity: the changing face of DNA finge [printing. Trends Biotechnol. 10:96-102.

Erlich H. A., D. Gelfand, J. J. Sninsky. 1991. Recent advances in the polymerase chain reaction.

Science 252: 1643-1651.

Gillani 1. C. 1987. Non-radioactive probes for specific DNA sequences. Trends Biotechnol. 5: 332334.

Hartskeerl R. A., M. Y. L.. De Wit, P. R. Klatser. 1989. Polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium teprae. J. Gen. Microbiol, 135: 2357-2364.

Jeffreys A. J., A. MacLeod, K. Tamaki, D. L. Neil, D. G. Monckton. 1991. Mini satellite repeat coding as a digital approach to DNA typing. Nature 354: 204-209.

Kingsbury D. T. 1987. DNA probes in the diagnosis of genetic and infectious diseases. Trends Biotechnol. 5: 107-111.

Klevan L., G. Gebeyehu. 1990. Biotinylated nucleotides for labeling and detecting DNA. Methods Enzymol. 184: 561-577.

Kohler G., С. Milstcin, 1975. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495—497.

Kuppuswamy M. N., J. VV. Hoffmann, C. K. Kasper, S. G. Spitzer, S. L· Groce, S. P. Bajaj.

1991. Single nucleotide primer extensioin to detect genetic diseases: cAperimental application to hemophilia В (factor IX) and cystic fibrosis genes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:1143-1147.

Mathews J. A., L. J. Kricka. 1988. Analytical strategies for the use of DNA probes. Anal. Biochem. 169: 1-25.

Nickerson D. A., R. Kaiser, S. Lappin, J. Stewart, L Hood, U. Landegren. 1990. Automated DNA diagnostic using an ELlSA-based oligonucleotide ligation assay. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 8923-8927. '

Persing D. H., T. F. Smith, F. C. Tenover, T. J. White

(ed.). 1993. Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications. Ametican Society for Microbiology, Washington, D.C.

Plikaytis В. В., R. H. Gelber, T. M. Shinnick. 1990. Rapid and sensitive detection of Mycohacterium leprae using a nested-prime r gene amplification assay. /. Clin. Microbiol. 28: 19131917.

Pollard-Knigth D., A. C. Simmonds, A. P. Schaap, H. Akhavan, M. A. W. Brady. 1990. Nonradio-active DNA detection on Southern blots by en/y-matically triggered chemiluminescence.

Anal. Biochem. 185: 353-358.

Etafalski J. A., S. V. Tingey. 1993. Genetic diagnostics in plant breeding: RAPDs, microsatellites and machines. Trends Genet. 9: 275-279.

Saiki R. K., P. S, Walsh, C. H. Levenson, H. A. Fjlich. 1989. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Nail. Acad. Sei. USA 86:6230-6234.

Sayler G. S., A. C. Layton. 1990. Environmental application of nucleic acid hybridization. Anna. Rev, Microbiol. 44: 625-648.

Tyagi S., F.R. Κramer. 1996. Molecular beacons: probes that fluorescence upon hybridization.

Nat. Bwtechnol. 14: 303-308.

Waldmann T. A. 1991. Monoclonal antibodies in diagnosis and therapy. Science 252: 1657—1662. Weiss J. B. 1995. DNA probes and PCR for diagnosis of parasitic infections. Clin. Microbiol. Rev.

8: 113-130.

White T. J., N. Arnheim, H. A. Erlich. 1989. The polymerase chain reaction. Trends Genet. 5: 18;:.--L8S

White T. J., R. Made], D. H. Persuig. 1992. The polymerase chain reaction: clinical applications.

Adv. Clin, Chem. 29: 161-196.

Winter G., C. Milstein. 1991. Man-made antibodies. Nature 349: 293-299.

Vu K. F., A. Van Deynze, K. P. Pauls. 1993. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis, p. 287-301. In B.R. Click and J.E. Thompson (ed.). Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology. CRC Press, Boca Raton, Fla,

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Кратко опишите, как с помощью ПЦР можно выявить изменения в гене ß-глобина человека, приводящие к серповидноклеточной анемии.

2.Изложите принцип метода ПЦР/ЛОЗ.

3.Что такое метод EL1SA?

4.Опишите три способа нерадиоактивного мечения ДНК. Каковы преимущества нерадиоактивных методов детекции?

5.Перед вами стоит задача разработать простой, чувствительный и воспроизводимый тест для обнаружения содержащего двухцепочечную ДНК вируса, вызывающего летальную инфекцию у крупного рогатого скота. Поскольку эффективность лечения зависит от ранней и точной диагностики заболевания, необходимо использовать методы, позволяющие выявлять вирус при его минимальном содержании в организме инфицированного животного, еще до появления каких-либо симптомов заболевания. Кратко опишите и обоснуйте последовательность ваших действий.

6.Что означают чувствительность, специфичность и простота применительно к диагностическим тестам?

7.Как в настоящее время диагностируют болезнь Чагаса? Каким образом можно усовершенствовать существующую процедуру?

8.Почему использование флуоресцентных красителей облегчает обнаружение специфических нуклеотидных последовательностей?

9.Что такое зонд — «молекулярный маяк» и как он действует?

10.Что такое геномная дактилоскопия и как ее используют для характеристики следовых количеств ДНК в судебной медицине?

11.Что представляет собой метод RAPD и как его используют для выявления генетических вариантов растительных культур?

ГЛАВА 10.

Микробиологическое производство лекарственных средств

До появления технологии рекомбинантных ДНК многие лекарственные препараты на основе белков человека удавалось получать только в небольших количествах, их производство обходилось очень дорого, а механизм биологического действия иногда был недостаточно изучен. Предполагалось, что с помощью новой технологии можно будет получать весь спектр таких препаратов в количествах, достаточных как для их эффективного тестирования, так и для применения в клинике. И эти ожидания оправдались. На сегодняшний день клонировано более 400 генов (в основном в виде кДНК) различных белков человека, которые в принципе могут стать лекарственными препаратами. Большинство этих генов уже экспрессированы в клетках-хозяевах, и сейчас их продукты проходят проверку на возможность применения для лечения различных заболеваний человека (табл. 10.1). Впрочем, хотя более 30 таких биотехнологических препаратов и получило одобрение в США (табл. 10,2), пройдет еще несколько лет, прежде чем они будут рекомендованы для широкого использования и поступят в продажу; вначале их подвергнут проверке на животных и проведут тщательные клинические испытания. Однако фармацевтические фирмы уже сейчас проявляют к ним интерес. По подсчетам специалистов, ежегодный объем мирового рынка лекарственных препаратов на основе белков человека составляет около 150 млрд. долларов и постоянно растет. Объем мирового рынка лекарственных средств на основе рекомбинантных белков увеличивается на 12—14% в год и к 2000 г. составит примерно 20 млрд. долларов.

Разработка новых методов профилактики и лечения многих заболеваний человека внесла огромный вклад в рост благосостояния людей в XX в, Однако этот процесс никогда нельзя считать завершенным. Так называемые «старые» заболевания (например, туберкулез) могут дать о себе знать вновь, как только будут ослаблены профилактические меры или появятся резистентные штаммы. Весьма привлекательной выглядит перспектива применения в качестве терапевтических средств специфических антител; их можно будет использовать для нейтрализации токсинов, борьбы с бактериями, вирусами, для лечения раковых заболеваний. Антитело можно уподобить самонаводящейся ракете, которая либо нейтрализует «нарушителя» — чужеродный агент, либо, если она оснащена «боеголовкой», разрушает специфическую клеткумишень. К сожалению, несмотря на многообещающие возможности, антитела довольно редко применялись для профилактики и лечения болезней и других патологий. И лишь в последнее время, с развитием технологии рекомбинантных ДНК и разработкой методов получения моноклональных антител и с расшифровкой молекулярной структуры и функции иммуноглобулинов, интерес к применению специфических антител для лечения различных заболеваний вновь пробудился.

Лекарственные препараты

Выделение кДНК интерферонов

Для выделения генов или кДНК белков человека используют разные подходы. В ряде случаев выделяют нужный белок и определяют аминокислотную последовательность соответствую-

Интерфероны человека, полученные методом генной инженерии

Первый ген интерферона был выделен в начале 80-х гг. С тех пор было обнаружено несколько разных интерферонов. Как мы уже говорили, исходя из химических и биологических свойств всех их можно подразделить на три группы: ИФα, ИΦβ и ИФγ. ИФα и ИΦβ синтезируются клетками, обработанными препаратами вирусов или вирусной РНК, а ИФγ вырабатывается в ответ на действие веществ, стимулирующих рост клеток. ИФα кодируется семейством генов, включающим как минимум 15 неаллельных генов, в то время как ИΦβ и ИФγ колируются одним геном каждый. Подтипы ИФα проявляют разную специфичность. Например, при проверке эффективности ИФα1 и ИФα2 на обработанной вирусом линии клеток быка эти интерфероны проявляют сходную противовирусную активность, в случае же обработанных вирусом клеток человека ИФα2 оказывается в семь раз активнее, чем ИФα1. Если противовирусная активность проверяется на клетках мыши, то ИФα2 оказывается в 30 раз менее эффективным, чем ИФα1.

Было предпринято несколько попыток создать ИФ с комбинированными свойствами, используя тот факт, что члены семейства ИФα различаются по степени и специфичности своей противовирусной активности. Теоретически этого можно достичь, соединив части последовательностей генов разных ИФα. Это приведет к образованию гибридного белка с другими свойствами, чем у каждого из исходных белков. Сравнение последовательностей кДНК ИФα1 и ИФα2 показало, что они содержат одинаковые сайты рестрикции в позициях 60, 92 и 150. После расщепления обеих кДНК в этих сайтах и последующего лигирования фрагментов было получено несколько гибридных генов (рис. 10.1). Эти гены экспрессировали в Е. coli, синтезированные белки очистили и исследовали их биологические функции. Проверка защитных свойств гибридных ИΦ на культуре клеток млекопитающих показала, что некоторые из них проявляют большую активность, чем родительские молекулы. Кроме того, многие гибридные ИФ индуцировали образование 2'—5'- олигоизоаденилат-синтетазы в контрольных клетках. Этот фермент участвует в синтезе 2'— 5'-связанных олигонуклеотидов, которые в свою очередь активируют латентную клеточную эндорибонуклеазу, расщепляющую вирусную мРНК. Другие гибридные ИФ проявляли большую, чем родительские молекулы, антипролиферативную активность в культурах различных раковых клеток человека.

Рис. 10.1. Структура генов ИФ , ИФ и четырех гибридных генов. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов ИФ 2 и ИФ 3 обнаруживает наличие у них одинаковых сайтов для рестрицирующих эндонуклеаз (RE1, RE2, RE3).

Рестрикция по этим сайтам и лигирование полученных фрагментов приводят к образованию различных гибридных генов. В нижней части рисунка представлены четыре из них.

Гормон роста человека, полученный методом генной инженерии

Стратегию конструирования новых белков путем замены функциональных доменов или с помощью направленного мутагенеза можно использовать для усиления или ослабления биологического действия белка. Например, нативный гормон роста человека (ГРЧ) связывается в разных типах клеток как с рецептором гормона роста, так и с пролактиновым рецептором.

Чтобы избежать нежелательных побочных эффектов в процессе лечения, нужно исключить присоединение ГРЧ к пролактиновому рецептору. Поскольку участок молекулы гормона роста, связывающийся с этим рецептором, по своей аминокислотной последовательности лишь частично совпадает с участком молекулы, который взаимодействует с пролактиновым рецептором, удалось избирательно снизить связывание гормона с последним. Для этого использовали сайт-специфический мутагенез, в результате которого произошли определенные изменения в боковых группах некоторых аминокислот (His-18, His-21 и Glu-174) — лигандов для ионов Zn2+, необходимых для высокоаффинного связывания ГРЧ с пролакгиновым рецептором (рис. 10.2). Модифицированный гормон роста связывается только со «своим» рецептором. Полученные результаты представляют несомненный интерес, но смогут ли модифицированные ГРЧ найти применение в клинике, пока неясно.

Оптимизация генной экспрессии

Недостаточно создать новый белок, важно оптимизировать экспрессию его гена. Для начала исследователи определяют возможность синтеза достаточных количеств аутентичного белка в прокариотической или эукариотической системах экспрессии. Прокариотическим системам отдается предпочтение, поскольку работа с ними обходится дешевле, а производительность выше. К сожалению, не все микроорганизмы синтезируют функциональные формы гетерологичных белков с одинаковой эффективностью, поэтому необходимо проводить сравнительные количественные оценки.

При изучении экспрессии гена интерлейкина-3 человека в различных клеткаххозяевах «наилучшим» хозяином оказалась Bacillus licheniformis (табл. 10.4). Хотя в одной из систем Е, coli был достигнут несколько более высокий уровень экспрессии, полученный белок мол. массой 20 кДа представлял собой продукт слияния интерлейкина-3 с участком ß-галактозидазы Е. coli, a не зрелый аутентичный белок мол. массой 15 кДа. Как правило, подобный химерный белок нельзя использовать в качестве лекарственного средства. Клетки дрожжей Kluyveromyces lactis и Saccharomyces cerevisiae, а также клетки человека были способны гликозилировать интерлейкин-3, однако уровень экспрессии в них был относительно низок. Гликозилирование не оказывает заметного влияния на активность интерлейкина-3, но ведет к ощутимой разнице в размерах молекулы.

Рис. 10.2.

Схематическое изображение нативной и модифицированной форм гормона роста человека (ГРЧ). С

помощью олигонуклеотиднаправленного мутагенеза получена форма ГРЧ, утратившая способность связываться с пролактиновым рецептором, но сохранившая специфичность к рецептору гормона роста.

хозяин

1) Из работы van Leen et al, Bio/Technology 9: 47-52, 1991, с изменениями. 2) В каждом случае использовался один из наиболее сильных промоторов, «работающих» в данной системе.

Ферменты

ДНКаза I

Наиболее частым летальным наследственным заболеванием среди европеоидов является муковисцидоз. В США выявлено 30 000 случаев этого заболевания, в Канаде и странах Европы - 23 000. Пациенты с муковисцидозом часто страдают инфекционными заболеваниями, поражающими легкие. Лечение рецидивирующих инфекций антибиотиками в конце концов приводит к появлению резистентных штаммов патогенных бактерий. Бактерии и продукты их лизиса вызывают накопление в легких вязкой слизи, затрудняющей дыхание. Одним из компонентов слизи является высокомолекулярная ДНК, которая высвобождается из бактериальных клеток при лизисе. Ученые из биотехнологической компании Genentech (США) выделили и экспрессировали ген ДНКазы — фермента, который расщепляет высокомолекулярную ДНК на более короткие фрагменты. Очищенный фермент вводят в составе аэрозоля в легкие больных муковисцидозом, он расщепляет ДНК, вязкость слизи снижается, что облегчает дыхание. Хотя эти меры и не излечивают муковисцидоз, они облегчают состояние больного. Применение данного фермента было недавно одобрено Департаментом по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США), и объем его продаж составил в 2000 г. примерно 100 млн. долларов.

Альгинат-лиаза

Альгинат - это полисахарид, синтезируемый целым рядом морских водорослей, а также почвенными и морскими бактериями. Его мономерными единицами являются два сахарида – ß-D-маннуронат и a-L-гулуронат, относительное содержание и распределение которых и определяют свойства конкретного альгината. Так, остатки a-L-гулуроната образуют межцепочечные и внутрицепочечные сшивки путем связывания ионов кальция; остатки ß-D- маннуроната связывают ионы других металлов, Альгинат, содержащий такие сшивки, образует эластичный гель, вязкость которого прямо пропорциональна размеру полисахаридных молекул.

Выделение альгината слизистыми штаммами Pseudomonas aemginosa существенно повышает вязкость слизи у больных муковисцидозом. Чтобы очистить дыхательные пути и облегчить состояние больных, в дополнение к обработке ДНКазой I следует провести деполимеризацию альгината с помощью альгинат-лиазы.

Ген альгинат-лиазы был выделен из Flavobacterium sp., грамотрицательной почвенной бактерии, ативно вырабатывающей этот фермент. На основе E. coli был создан банк клонов Flavobacterium и проведен скрининг тех из них, которые синтезируют альгинат-лиазу, путем высевания всех клонов на твердую среду, содержащую альгинат, с добавлением ионов кальция. В таких условиях весь альгинат, находящийся в среде, за исключением того, который окружает продуцирующие альгинат-лиазу колонии, образует сшивки и становится мутным. Гидролизованный альгинат теряет способность к формированию сшивок, поэтому среда вокруг синтезирующих альгинатлиазу колоний остается прозрачной-Анализ клонированного фрагмента ДНК, присутствующего в одной из положительных колоний, показал наличие открытой рамки считывания, кодирующей полипептид мол. массой около 69 000. Более детальные биохимические и

Рис. 10.3. Процессинг белка — предшественника рекомбинантной альгинат-лиазы Flavobacterium, происходящий в Е. coli. В результате отщепления от белка мол. массой 69 кДа пептида 6 кДа образуется белок мол. массой 63 кДа, способный деполимеризовать альгинат морских водорослей и бактериальный альгинат. Расщепление белка 63 кДа дает белок мол. массой 23 кДа, активно деполимеризующий альгинат морских водорослей, и белок мол. массой 40 кДа, гидролизу ющий бактериальный альгинат.

генетические исследования показали, что этот полипептид, по-видимому, является предшественником трех альгинат-лиаз, вырабатываемых Flavobacterium sp. (рис. 10.3). Сначала какой-то протеолитический фермент отрезает от него N-концевой пептид массой около 6000. Оставшийся белок мол. массой 63 000 способен деполимеризовать альгинат, вырабатываемый как бактериями, так и морскими водорослями. При его последующем разрезании образуется продукт мол. массой 23 000, деполимеризующий альгинат морских водорослей, и фермент мол. массой 40 000, разрушающий альгинат бактерий. Для получения больших количеств фермента мол. массой 40 000 кодирующую его ДНК амплифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), а затем встраивали в выделенный из В. subtilis плазмидный вектор, несущий ген, кодируюший сигнальный пептид α-амилазы В. sitbtüis. Транскрипцию контролировали при помощи системы экспрессии гена пенициллиназы (рис. 10.4). При

трансформации клеток В. subtilis полученной плазмидой и высевании их на содержащую альгинат твердую среду с добавлением ионов кальция образовались колонии с большим ореолом. Когда такие колонии выращивали в жидкой среде, ре-комбинантная альгинат-лиаза выделялась в культуральную среду. Последующие тесты показали, что этот фермент способен эффективно разжижать альгинаты, синтезируемые слизистыми штаммами P. aeruginosa, которые были выделены из легких больных муковисцидозом. Для того чтобы определить, целесообразно ли проводить клиническое тестирование рекомбинантной альгинат-лиазы, нужны дополнительные исследования.

Моноклональные антитела как лекарственные средства

Примерно 100 лет назад была предпринята попытка лечения детей, больных дифтерией, с помощью неочищенной антисыворотки, получен-

Рис. 10.4. ДНК, кодирующая альгинат-лиазу мол. массой 40 кДа. К последовательности, кодирующей N-конец альгинат-лиазы, присоединен сегмент гена α-амилазы В. subtilis, кодирующий ее сигнальный пептид. Транскрипция контролируется при помощи системы экспрессии гена пенициллиназы В. subtilis.