Molekulyarnaya_biotekhnologia_Glik_B__Pasternak_Dzh

Вакцины 241

руса бешенства, поверхностного антигена гепатита В, поверхностных белков вируса Синдбис, NP- и НА-белков вируса гриппа, N- и G-белков вируса везикулярного стоматита, гликопротеинов вируса простого герпеса. Некоторые из полученных на основе ВКО рекомбинантных векторов можно использовать для создания эффективных вакцин. Так, рекомбинантный ВКО, экспрессирующий ген гликопротеина D вируса простого герпеса типа 1, предотвращает герпесные инфекции у мышей, а рекомбинантный ВКО, экспрессирующий ген поверхностного антигена вируса бешенства, индуцирует выработку протективных антител у лис, основных переносчиков вируса бешенства в Европе.

Векторные ВКО-вакцины позволяют провести иммунизацию сразу от нескольких заболеваний. Для этого можно использовать рекомбинантный ВКО, который несет несколько генов, кодирующих разные антигены.

В зависимости от используемого ВКО-промотора чужеродный белок может синтезироваться в ранней или поздней фазе инфекционного цикла, при этом его количество определяется силой промотора. Обычно для достижения высокого уровня экспрессии используют «поздние» ВКО-промоторы: p11 (промотор гена, отвечающего за синтез белка мол. массой 11 кДа) или рСАЕ (промотор гена интегрального белка вируса коровьей оспы типа А). При встраивании в одну ДНК ВКО нескольких чужеродных генов каждый из них помещают под контроль отдельного ВКО-промотора, чтобы предотвратить гомологичную рекомбинацию между различными участками вирусной ДНК, которая может привести к утрате встроенных генов.

Живая рекомбинантная вирусная вакцина имеет ряд преимуществ перед неживыми вирусными и субъединичными вакцинами: 1) презентация аутентичного антигена практически не отличается от таковой при обычной инфекции; 2) вирус может реплицироваться в клетке-хозяине и увеличивать количество антигена, который активирует продукцию антител В-клетками (гуморальный иммунитет) и стимулирует выработку Т- клеток (клеточный иммунитет); 3) встраивание генов антигенных белков в один и большее число сайтов генома ВКО еще больше уменьшает его вирулентность.

Недостаток живой рекомбинантной вирусной вакцины состоит в том, что при вакцинации лиц со сниженным иммунным статусом (например, больных СПИДом) у них может развиться тяжелая вирусная инфекция. Чтобы решить эту проблему, можно встроить в вирусный вектор ген, кодирующий человеческий интерлейкин-2, который стимулирует Т- клеточный ответ и ограничивает пролиферацию вируса.

Нежелательные побочные эффекты пролиферации ВКО можно предупредить инактивацией вируса после вакцинации. Для этого был создан чувствительный к интерферону вирус (ВКО дикого типа относительно устойчив к его действию), пролиферацию которого можно регулировать в случае возникших при вакцинации осложнений.

Механизм устойчивости ВКО к интерферону оставался неустановленным, пока не была обнаружена открытая рамка считывания K3L, кодирующая белок мол. массой 10,5 кДа. Этот белок содержит аминокислотную последовательность, гомологичную N-концевой части эукариотического фактора инициации elF-2α мол. массой 36,1 кДа. N-концевые области обоих белков содержат 87 практически идентичных аминокислотных остатков, причем в положении 51 в обоих случаях находится серии, который в elF-2α фосфорилируется активируемой интерфероном Р1-киназой, что приводит к ингибированию синтеза белка в обработанных интерфероном клетках. К3L-белок действует как конкурентный ингибитор фосфорилирования elF-2α, обеспечивая устойчивость ВКО к интерферону, и если из генома ВКО удалить ген K3L или его часть, то вирус станет чувствительным к интерферону, С помощью ΠЦР-мутагене за гена K3L, находящегося в составе плазмиды, и последующей гомологичной рекомбинации между ДНК ВКО и плазмидой с целью замены К3Lпоследовательности дикого типа модифицированным вариантом был сконструирован мутантный ВКО K3L~ . Этот штамм оказался в 10—15 раз более чувствительным к интерферону, чем штамм дикого типа (рис. 11.11). Эта работа является важным этапом на пути создания более безопасных ВКО-векторов. Последовательности, сходные с K3L, могут содержать и другие устойчивые к интерферону вирусы, что позволит с помощью де-

мутантного штамма (K3L~). Мышиные клетки L929 перед инокуляцией вирусом обрабатывали в течение 24 ч смесью мышиных альфа- и бета-интерферонов. На каждой чашке, не обработанной интерфероном, было примерно 3-107 бляшек. (Paoletti, Tartaglia, U.S. patent 5,378,657, 1995, с изменениями).

леций создавать их штаммы, чувствительные к интерферону.

Большинство работ по созданию живых вирусных вакцин проводились на ВКО, однако в качестве кандидатов на роль векторов для вакцинации рассматриваются и другие вирусы: аденовирус, полиовирус и вирус ветряной оспы. Вектор на основе живого аттенуированного полиовируса (его исследования только начинаются) привлекателен тем, что позволяет проводить пероральную вакцинацию. Такие «слизистые» вакцины (вакцины, компоненты которых связываются с рецепторами, расположенными в легких или желудочно-кишечном тракте) пригодны для профилактики самых разных заболеваний: холеры, брюшного тифа, гриппа, пневмонии, мононуклеоза, бешенства, СПИДа, болезни Лайма. Но до любых клинических испытаний любого на первый взгляд безобидного вируса как системы доставки и экспрессии соответствующего гена необходимо убедиться в том, что он действительно безопасен. Например, повсеместно используемый ВКО вызывает у людей осложнения с частотой примерно 3,0-10-6. Поэтому из генома рекомбинантного вируса, который предполагается использовать для вакцинации человека, желательно удалить последовательности, ответственные за вирулентность.

Противобактериальные вакцины

Для лечения заболеваний, вызываемых бактериями, широко используются антибиотики, и лишь совсем недавно начались работы по созданию противобактериальных вакцин. Стимулом к этому стали весьма веские причины.

•Не все бактериальные инфекции поддаются лечению антибиотиками.

•Широкое использование антибиотиков в последние 40 лет привело к появлению большого числа устойчивых к ним бактериальных штаммов.

•Во многих тропических странах отсутствуют условия для хранения антибиотиков.

•Часто больные прекращают лечение раньше, чем это предписано врачом, или принимают антибиотики в недостаточной дозе.

Имея в виду, что создаваемая противобактериальная вакцина должна быть достаточно эффективной, важно выбрать правильную стратегию. Если патогенная бактерия плохо растет в культуре и сложно получить ее аттенуированный штамм, необходимо использовать альтернативные способы. Например, Rickettsia rickettsii, грамотрицательная облигатная внутриклеточная бактерия, вызывающая пятнистую лихорадку Скалистых гор, не растет в культуре. Чтобы обойти эту трудность, создали субъединичную вакцину, содержащую основной поверхностный антиген R. rickettsii, белок мол. массой 155 кДа. Она эффективно защищала мышей от этой патогенной бактерии.

Бактерии кок системы доставки антигенов

Антигены, находящиеся на наружной поверхности бактериальной клетки, обладают более высокой иммуногенностью, чем локализованные в цитоплазме. Поэтому один из подходов, исполь-

Вакцины 243

зуемых при создании вакцин, состоит в размещении протективного антигена патогенной бактерии на поверхности живой непатогенной бактерии. Многие бактерии имеют жгутики, состоящие из белка флагеллина; под микроскопом они выглядят как нити, отходящие от бактериальной клетки. Если сделать так, что жгутики непатогенного микроорганизма будут нести специфический эпитоп патогенного микроорганизма, то можно будет индуцировать выработку протективных антител.

Именно такой подход использовали при создании противохолерной вакцины. Синтетический олигонуклеотид, кодирующий эпитоп субъединицы В холерного токсина, встроили в гипервариабельный участок гена флагеллина Salmonella и полученную конструкцию ввели в дефектный по флагеллину штамм Salmonella. При этом было известно, что эпитоп, включающий 50—64 аминокислотные остатки субъединицы В холерного токсина, индуцирует выработку антител к интактному холерному токсину. Химерный флагеллин нормально функционировал, а эпитоп холерного токсина размещался на поверхности жгутиков. Иммунизация мышей с помощью интраперитонеальной инъекции примерно 5-106 живых или убитых формалином бактерий с модифицированным флагеллином индуцировала выработку большого количества антител как к пептиду (50—64 аминокислотным остаткам), так и к молекуле интактного холерного токсина. Аналогичным образом можно встраивать два и даже три разных эпитопа в один флагеллиновый ген Salmonella и создать поливалентную противобактериальную вакцину.

С помощью перорального введения аттенуированных штаммов Salmonella можно осуществлять доставку в организм хозяина многих бактериальных, вирусных и паразитарных антигенов. Большую роль при этом играет выбор промотора, контролирующего транскрипцию чужеродного гена. Если используется слишком сильный промотор, может возникнуть метаболическая «перегрузка», сдерживающая пролиферацию бактерий. В отличие от ферментера, организм животного-хозяина не является замкнутой системой, и экспрессию чужеродного гена нельзя регулировать изменением температуры или добавлением специфических метаболитов. Регуляторную роль может играть только промотор, реагирующий на те или иные сигналы. Например, работу промотора nirB E. coli можно регулировать, изменяя содержание нитритов и кислорода в среде, а наиболее активен он в анаэробных условиях. В одном из экспериментов промотор nirB использовали для контроля экспрессии гена нетоксичного иммуногенного С-фрагмента столбнячного токсина в аттенуированном штамме Salmonella. В развивающихся странах инфекция Clostridium tetani уносит более 1 млн. жизней в год. Если генетически модифицированный штамм Salmonella выращивать в аэробных условиях, то С-фрагмент столбнячного токсина синтезироваться не будет. При пероральном же введении этой бактерии тестируемым мышам С-фрагмент синтезируется, и у животных вырабатываются антитела к нему. Таким образом, штамм Salmonella, в который встроен С-фрагмент столбнячного токсина, находящийся под контролем промотора nirB, можно использовать как живую пероральную противостолбнячную вакцину. Чтобы выяснить, насколько эффективен этот подход при вакцинации человека, необходимо провести дополнительные исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Традиционные вакцины содержат инактивированные или аттенуированные патогенные микроорганизмы (бактерии или вирусы). Эти вакцины имеют ряд недостатков: не все патогенные микроорганизмы можно вырастить в необходимых для производства вакцины количествах; работа с большим количеством патогенных микроорганизмов требует соблюдения строжайших мер предосторожности; аттенуированные штаммы нередко ревертируют и становятся вирулентными; инактивация часто бывает неполной; срок годности вакцины зависит от условий ее хранения.

Технология рекомбинантных ДНК позволяет создавать надежные вакцины, используя при этом разные подходы. Делетируя гены, ответственные за вирулентность, получают живые вакцины, содержащие непатогенные, иммунолога-чески активные штаммы, которые не могут

ревертировать и становиться патогенными. Клонированные гены, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенного организма, встраивают в геном непатогенного носителя (обычно вируса) и получают безопасную, не содержащую болезнетворных микроорганизмов вакцину. Наконец, гены или их сегменты, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенных микроорганизмов, встраивают в экспрессирующие векторы, получают нужный продукт в большом количестве и используют его как вакцину. Последний подход позволяет производить субъединичные и пептидные вакцины (если используются полноразмерные гены в первом случае и фрагменты генов, кодирующих домены основных антигенных детерминант — во втором). Пептидные вакцины получают и с помощью химического синтеза пептидов.

ЛИТЕРАТУРА

Andio R., D. Silvera, S. D. Suggett, P. L. Achacoso,

C.J. Miller, D. Baltimore, M. B. Feinberg. 1994. Engineering poliovirus as a vaccine vector for the expression of diverse antigens. Science 265: 1448-1451.

Bittle J. L., R. A, Houghten, H. Alexander, T. M. Shinnick, J. G. Sutcliffc, R. A. Lernen,

D.J. Rowlands, F, Brown. 1982. Protection against foot-and-mouth disease by immunization with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence. Nature 298: 30-33.

Blancou J., M. P. Kieny, R. Lathe, J. P. Lecoq, P. P. Pastoret, J. P. Soulebot, P. Desmettre.

1986. Oral vaccination of the fox against rabies using a live recombinant vaccinia vaccine. Nature 322: 373-375.

Blasco R., B. Moss. 1995, Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque formation. GeneW: 157-162.

Boothroyd J. C., P. E. Highfîeld, G. A, M. Cross, D. J. Rowlands, P. A. Lowe, F. Brown, T. J. R. Harris. 1981. Molecular cloning of foot and mouth disease virus genome and nucleotide sequences in the structural protein genes. Nature 290: 800-802.

Brown Г. 1984. Synthetic viral vaccines. Annu. Rev. A/kro&O/. 38:221-235.

Brown F. 1985. Peptides as the next generation of foot-and-mouth disease vaccines. Bio/Technology 3:445-448.

Burnette W. N. 1990. The advent of recombinant pertussis vaccines. Bio/Technology 8: 1003-1005. Charles L, G. Dougan. 1990. Gene expression and the development of live enteric vaccines. Trends

Biotechnol. 8:117-121.

Chatfield S. N., I. G. Charles, A. J. Makoff, M. D. Oxer, G. Dougan, D. Pickard, D. Slater, N. F. Fairweather. 1992. Use of the nirB promoter to direct the slnble expression of heterologous antigens in Salmonella oral vaccine strains: development of a single-dose oral tetanus vaccine. Bio/Technology

10:888-892.

Chow M., R. Yabrov, J. Bittle, J. Hogle, D. Baltimore. 1985. Synthetic peptides from four

separate regions of the poliovirus type 1 capsid protein VP1 induce neutralizing antibodies. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 910-914.

Clarke B. E., S. E. Newton, A. R, Carroll, M. J. Francis, G. Appleyard, A. D. Syred, P. E. Highfield, D. J. Rowlands, F. Brown. 1987. Improved immunogenicity of a peptide epitope after fusion to hepatitis В core protein. Nature 330: 381-384.

Cohen J. 1993. Naked DNA points way to vaccines. Science 259: 1691-1692.

Cremer К. J., M. Macketl, С. Wohlenberg, A. L. Notkins, B. Moss. 1985. Vaccinia virus recombinant expressing herpes simplex virus type 1 glycoprotein D prevents latent herpes in mice. Science. 228: 737-740.

DiMarchi R., G. Brooke, C. Gale, V. Cracknel), T. Doel, N. Mowat. 1986. Protection of cattle against foot-and-mouth disease by a synthetic peptide. Science 232: 639-641.

Ferguson M. 1991. Progress towards rabies control. Trends Biotechnol. 9: 7—11.

Finkelstein A., R. F. Silva. 1989. Live recombinant vaccines for poultry. Trends Biotechnol. 7: 273-277.

Flexner C., A. Hugin, B. Moss. 1987. Prevention of vaccinia virus infection in immunodeficient mice by vector-directed IL-2 expression. Nature 330: 759 262

Вакцины 245

Graham F. L. 1990. Adenoviruses as expression vector and recombinant vaccines. Trends Biotechnoi. 8: 85-87.

Horwitz M. A., B.-W. E. Lee, B. J. Dillon, G. Harth, 1995. Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination with major extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 1530-1534.

Jones T. R., S. L. Hoffman. 1994. Malaria) vaccine development. Clin. Microbioi. Rev. 7: 303—310. Kaper J. B., H. Lockman, M. M. Baldini, M. M. Levine. 1984. A recombinant live oral choiera

vaccine. Bio/Technology 2: 345-349.

Kaper J. В., H. Lockman, M. M. Baldini, M. M. Levine. 1984. Recombinant nontoxinogenic Vibrio choier-ae strains as attenuated cholera vaccine candidates. Nature 308: 655-658.

Kaper J. В., J. G. Morris, Jr., M. M. Levine. 1995. Choiera. Clin. Microbioi. Rev. 8: 48-86.

Kaslow D. C., S. N. Isaacs L A. Quakyi, R. W. Gwadz, B, Moss, D. B. Keister. 1991. Induction of

Plasmodium falciparum transmission-blocking antibodies by recombinant vaccinia virus. Science 252: 13101313.

Кupper H., W. Keller, С. Kurz, S. Forss, H. Schauer, R. Franze, K. Strohmaier, O. Marquardt, V. G. Zaslavsky, P. H. Hofschneidtr. 1981. Cloning of cDNA of major antigen of fool and mouth disease virus and expression in E. colt. Nature 289: 555-559.

Lasky L. A., D. Dowbenko, C. C. Simonsen, P. W. Berman. 1984. Protection of mice from lethal herpes simplex virus infection by vaccination with a secreted form of cloned glycoprotein D. Bio/Technology 2: 527-532.

Lowe R. S., P. M. Keller, B..!. Ketch, A. J. Uavison, Y. Whang, A. J. Morgan, E. KicfT, R. W. Elfe. 1987. Varicella-zoster virus as a live vector for the expression of foreign genes, Proc. Natl. Acad. ScL USA 84: 3896-3900.

Mekalanos J. J., J. C. Sadoff. 1994. Cholera vaccines: fighting an ancient scourge. Science 265: 13871389.

Michel M.-L., H. L. Davis, M. Schleef, M. Mancini, P. Tiollais, R. G. Whalen. 1995. DNA-mediated immunization to the hepatitis В surface antigen in mice: aspects of the humoral response mimic hepatitis В viral infection in humans. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 5307-5311.

Miner J. N., D. E. Hruby. 1990. Vaccinia virus: a versatile tool for molecular biologists. Trends Biotechnoi 8: 20-25.

Moss B. 1991Vaccinia virus: a tool for research and vaccine development, Science252: 1662—1667. Nabel G. J., P. L· Feigner. 1993. Direct gene transfer for immunotherapy and immunization. Tnends

Biotechnoi. 11:211-215.

Newton S. M. C., C. O. Jacob, B. A. U. Stocker. 1989. Immunoresponse to cholera toxin upitope inserted in Salmonella flagellin. Science 244: 70-72.

Nussenzweig R. S., C. A. Long. 1994. Malaria vaccines: multiple targets. Science 265: 1381—1383. Oehen S., H. Hengartner, R. M. Zinkernagel. 1991. Vaccination for disease. Science 251: 195-197. Paoletti E., J. TarlagHa January 1995. Interferon sensitive recombinant poxvirus vaccine. U.S. patent 5,

378,457.

Ratafia M. 1987. Worldwide opportunities in genetically engineered vaccines. Bio/Technology 5: N541158.

Sizemore D, R., A. A. Branstrom, J. C. Sadoff. 1995, Attenuated Shigella as a DNA delivery vehicle for DNA-mediated immunization. Science 270: 299-302.

Stover C. K., V. F. de la Cruz, T. R. Fuerst, J. E. Buriein, L· A. Benson, L.T Bennett, G. P. Bansal, J. F. Young, M. H. Lee, G. F. Hatfull, S. B. Snapper, R. G. Barletta, W. R. Jacobs, Jr., B. R. Bloom. 1991. New use of BCG for recombinant vaccines. Nature 351: 456—460.

Tang D.-C-, M. DeVit, S. A. Johnston. 1992. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature 356: 152-154.

Tartaglia J., E. Paoletti. 1988. Recombinant vaccinia virus vaccines. Trends Biotechnoi. 6: 43-46.

Titus R. GM J. G. Gueiros-Filtio, L. A. R. De Freitas, S. M. Beverly. 1995. Development of a safe live

Leishmania vaccine line by gene replacement. Proc. Natl. Acad. Sei. USA92: 10267-10271.

Uhner J. В., J. J. Donnelly, S. Parker, G. II. Rhodes, P. L. Feigner, V. J. Dwarki, S. H. Gromkowski, R. R. Deck, C. M, DeWïtt, A. Friedman, L. A. I lawe, K. R. Leander, D. Martine/, H. C. Perry, J. W. Shiver, D. I,. Montgomery, M. A. Liu. 1993.

Heterologous protection against influenza by injection of DN A encoding a viral protein. Science 259: 1745-1749.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Опишите вкратце способ создания вакцины против бактерий, продуцирующих токсин.

2.Что ограничивает применение традиционных вакцин?

3.Предположим, что вы принимаете участие в работе международной организации по охране здоровья животных и вам нужно создать вакцину против крайне вирулентного вируса крупного рогатого скота. Известно, что геном представляет собой полиаденилированную линейную одноцепочечную РНК длиной 10 т. п. н. и содержит восемь разных генов. Вирус не имеет оболочки, его основной антигенной детерминантой является белок капсида (VP 2). Какую стратегию вы используете?

4.Какие подходы применяются при создании пептидных противовирусных вакцин?

5.Что представляет собой вирус коровьей оспы и как с его помощью можно получать уникальные живые рекомбинантные вакцины?

6.Предположим, что вы выделили РНК-содержащий вирус, вызывающий бешенство у скунсов и енотов. Как на основе этого очищенного вируса создать рекомбинантную вакцину, защищающую животных от бешенства?

7.Как работник Всемирной организации здравоохранения вы должны найти оптимальный способ искоренения бешенства в популяциях диких животных. Предположим, что у вас есть пептидная вакцина и вакцина на основе вируса коровьей оспы; выберите одну из них и обоснуйте ваше решение.

8.Как можно использовать в качестве вакцины бактерии со жгутиками?

9.Перечислите преимущества живой рекомбинантной вирусной вакцины перед неживой

исубъединичной вакцинами.

10.Опишите несколько подходов, использованных при создании холерной вакцины.

ГЛАВА 12 Использование рекомбинантных

микроорганизмов для получения коммерческих продуктов

До настоящего времени основной целью исследований в области молекулярной биотехнологии было получение различных белков. Однако технологию рекомбинантных ДНК можно использовать также для крупномасштабного производства многих ценных низкомолекулярных соединений — витаминов, аминокислот, антибиотиков и т. д.

При наличии эффективной системы экспрессии получение белка — продукта специфического гена - не составляет особого труда. Белок может представлять собой либо тот конечный продукт, который хотят получить (например, рестрицирующую эндонуклеазу), либо фермент, катализирующий определенную химическую реакцию (например, одну из реакций биосинтеза антибиотиков). Иногда в результате генетических манипуляций микроорганизм приобретает способность к синтезу нового фермента и может использоваться для получения in vivo низкомолекулярных соединений — витаминов, аминокислот, красителей, антибиотиков, предшественников различных биополимеров и т. д. Такой микроорганизм становится «фабрикой» по производству полезных метаболитов.

Эндонуклеазы рестрикции

Развитие технологии рекомбинантных ДНК было бы невозможно, если бы в распоряжении исследователей не было нужных эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). В настоящее время в продаже имеется более 300 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируются самыми разными микроорганизмами: аэробными, анаэробными, фотосинтезирующими, диазотрофными, мезотрофными, термофильными, психрофильными, медленно- и быстрорастущими. Для культивирования каждого из них необходимо подобрать оптимальные условия ферментации температуру, pH, состав среды, концентрацию кислорода — с тем чтобы максимизировать выход необходимого фермента. Чтобы не пришлось выращивать большое число разных микроорганизмов, готовить многокомпонентные среды, разрабатывать разные ферментеры и тратить время на подбор оптимальных условий роста для многочисленных организмов, часто клонируют гены эндонуклеаз рестрикции в Escherichia coli. Это позволяет стандартизовать условия получения необходимых продуктов. Кроме того, культура клеток Е. coli быстро достигает высокой плотности и может быть приспособлена для сверхпродукции необходимого фермента.

Технология выделения и экспрессии чужеродных генов в E. coli и в некоторых других микроорганизмах достаточно хорошо отработана, однако не стоит забывать, что синтез гетерологичного белка в организме-хозяине может оказывать на него негативное влияние. Например, сверхпродукция такого белка может привести к истощению метаболических ресурсов хозяйского организма и отрицательно повлиять на его рост. Присутствие гетерологичного белка может оказаться даже губительным для клетки-хозяина. Так, сайты рестрикции имеются во всех молекулах ДНК, и если продуктом клонированного гена является эндонуклеаза рестрикции, то в отсутствие специальных зашитных механизмов хозяйская ДНК будет расщепляться ею.

Микроорганизмы, синтезирующие эндонуклеазы рестрикции, выработали систему самозащиты: они метилируют одно или несколько оснований рестриктазного сайта, и расщепление ДНК в этом сайте гомологичной эндонуклеазой рестрикции блокируется. Грамотрицательные микроорганизмы имеют еще один механизм защиты: эндонуклеазы рестрикции у них локализованы в периплазматическом пространстве. Благодаря такой компартментализации происходит физическое разделение рестриктаз и ДНК и при этом обеспечивается свободный доступ метилирующего (модифицирующего) фермента к хромосомной ДНК. Кроме того, это защищает клетку от проникновения в нее любой чужеродной ДНК, например вирусной.

Один из подходов к решению проблемы деградации хозяйской ДНК гетерологичными эндонуклеазами рестрикции состоит в клонировании и экспрессии в реципиентном организме как гена фермента рестрикции, так и гена соответствующего модифицирующего фермента. Однако клонирование обоих этих генов в одном микроорганизме технически затруднено, если они расположены на хромосоме донорного организма далеко друг от друга. Кроме того, чтобы не допустить расщепления хозяйской ДНК эндонуклеазами рестрикции, метилирующий фермент после трансформации должен синтезироваться еще до начала синтеза рестриктазы.

На рис. 12.1 представлена стратегия выделения и клонирования в Е. coli гена рестриктазы Pstl грамотрицательной бактерии Providencia stuartii

1.ДНК P, stuartii расщепляют с помощью HindIII и встраивают фрагменты в HindIII- сайт плазмиды pBR322.

2.Рекомбинантными плазмидами трансформируют клетки E. соli НВ101 и выращивают их в жидкой среде, а затем инфицируют бактериофагом λ. Если в хозяйской клетке экспрессируется ген фермента рестрикции, то она оказывается устойчивой к литическому действию фагов типа λ, ДНК которых активно расщепляется синтезируемой рестриктазой.

3.Трансформированные клетки, устойчивые к фагу λ, подвергают осмотическому шоку, чтобы высвободить периплазматические белки. Определяют активность рестриктазы PstI в белковом экстракте.

4.Положительные клоны тестируют на наличие PstI-метилирующей активности.

Один положительный клон, выявленный в этом эксперименте, содержал встроенный фрагмент ДНК длиной 4 т. п. н. с интактным опероном рестриктазы и метилазы Art и промотором P. stuartii В клоне, несущем эту генетическую конструкцию, соблюдался естественный временной порядок синтеза: вначале синтезировался метилирующий фермент, затем эндонуклеаза рестрикции. Уровень экспрессии гена рестриктазы PsA в Е. colt был примерно в 10 раз выше, чем в P. stuartii. Как и предполагалось, рестриктаза находилась в периплазматическом пространстве, а метилаза — в цитоплазме. Метод получения PstI клонированием соответствующего гена в Е. соli гораздо более эффективен, чем выделение этого фермента из P. stuartii.

Для выделения генов, кодирующих ферменты рестрикции и модификации (метилирования), можно использовать также другой подход, который состоит в следующем,

1.Создают банк клонов ДНК организма-донора, продуцирующего известную эндонуклеазу рестрикции. Используемый при этом плазмидный вектор должен содержать по крайней мере один сайт узнавания для этой рестриктазы.

2.Трансформируют Е. colt гибридными плазмидами.

3.Из трансформированных клеток, выросших в жидкой селективной среде (т. е. из клеток, содержащих плазмиду), выделяют плазмиднуюДНК.

4.Обрабатывают ее интересующей исследователя эндонуклеазой рестрикции,

5.Трансформируют Е. coli плазмидными ДНК, обработанными эндонуклеазой рестрикции.

Ключевым моментом этого метода является то, что плазмидная ДНК клонов, несущих и экспрессирующих ген фермента модификации, оказывается устойчивой к расщеплению соответствующей эндонуклеазой рестрикции, поскольку сайты узнавания в ней метилированы.

Рис. 12.1. Клонирование гена рестриктазы PstI и отбор несущих его трансформированных бактериальных клеток. Хромосомную ДНК P. stuartii расщепляют HindIII и встраивают фрагменты в плазмиду pBR322. Трансформируют рекомбинантной плазмидой Е. coli, выращивают клетки в жидкой среде и инфицируют фагом λ. Отбирают трансформанты, устойчивые к фагу; именно они несут и э кспрессируют клонированный ген PstI.

Рассмотрим следующий пример. В плазмиду pBR322 встраивали HindIII-фрагменты ДНК Desulfovibrio desulfuricans и трансформировали ею клетки Е. coli. Выделенную из трансформированных клеток плазмидную ДНК обрабатывали рестриктазой DdeI. Плазмиды, несущие и экспрессирующие ген метилирующего фермента, не расщеплялись, поскольку все восемь сайтов узнавания DdeI в pBR322 были метилированы. Смесь плазмид, обработанных Ddel, использовали для трансформации E. coli. Образование трансформантов, несущих ген функционального модифицирующего фермента DdeI, обеспечивали только целые кольцевые молекулы плазмидных ДНК. Остальные плазмиды были расщеплены эндонуклеазой рестрикции. Для того чтобы определить, какие клоны содержат и ген фермента модификации, и ген эндонуклеазы рестрикции, трансформанты тестировали на наличие в них активной рестриктазы DdeI. Описанный подход можно с успехом использовать для выделения гена любой рестриктазы, лишь бы он находился достаточно близко к гену соответствующего модифицирующего фермента и

был встроен в плазмидный вектор, имеющий по меньшей мере один сайт узнавания для данного фермента.

Малые биологические молекулы

Используя технологию рекомбинантных ДНК, можно направленно изменять метаболизм микроорганизмов, вводя в них новые гены или модифицируя уже существующие. Основной целью таких изменений является создание рекомбинантного микроорганизма с новой ферментативной активностью, способного превращать существующий субстрат в ценный продукт, который обычно получают только сочетанием химических и микробиологических методов.

Синтез L-аскорбиновой кислоты

В настоящее время для крупномасштабного производства L-аскорбиновой кислоты (витамина С) используют весьма трудоемкий процесс, включающий одну микробиологическую стадию и несколько химических; исходным субстратом для него является D-глюкоза (рис. 12.2). На последнем этапе этого процесса 2-кето-L-гулоновая кислота (2-KLG) превращается в кислых условиях в L-аскорбиновую кислоту. Биохимические исследования метаболизма различных микроорганизмов показали, что 2- KLG можно получить другим путем. Так, одни бактерии (Acetobacter, Gluconobacter и Erwinia) могут превращать глюкозу в 2,5-дикето-О-глюконовую кислоту (2,5-DKG), а

другие (Corynebacterium, Brevibacterium и Arthrobacter), синтезирующие фермент 2,5-DKG-

редуктазу, — преобразовывать 2,5-DKG в 2-KLG.

Использующийся в настоящее время способ получения аскорбиновой кислоты можно усовершенствовать, если включить в него совместное культивирование указанных микроорганизмов для превращения глюкозы в 2-KLG. К сожалению, такое культивирование имеет свои трудности. Например, используемые микроорганизмы могут иметь разные оптимумы температуры и pH, могут различаться также состав среды и скорость роста. Иными словами, условия культивирования, оптимальные для одного организма, могут быть неприемлемы для другого, что приведет к спонтанному «вымыванию" из среды одного из них. В подобных случаях можно культивировать микроорганизмы последовательно (рис. 12.3), правда такой процесс трудно будет сделать непрерывным, если для роста микроорганизмов необходимы существенно разные среды. Наилучшим выходом из этой ситуации было бы создание одного микроорганизма, синтезирующего все ферменты, необходимые для превращения глюкозы в 2-KLG. Erwinia herbicola осуществляет превращение D-глюкозы в 2,5-DKG в несколько стадий, катализируемых разными ферментами, в то время как Corynebacterium sp. для превращения 2,5-DKG в 2-KLG необходима только одна стадия. Следовательно, наиболее простой способ создания одного микроорганизма, способного превращать D-глюкозу в 2-KLG, состоит в выделении гена 2,5-

ОКО-редуктазы Coiynebacterium sp. и введении его в Erwmia herbicoia.

Первый шаг на этом пути состоит в выделении и очистке 2,5-DКG-редуктазы Coiynebacterium sp. и определении последовательности ее первых 40 N-концевых аминокислот. Исходя из этих данных были синтезированы два 43-нуклеотидных гибридизационных зонда, соответствовавших разным частям белковой молекулы. Поскольку 71% нуклеотидов ДНК Corynebacterium sp. представляют собой либо G, либо С, зонды синтезировали таким образом, чтобы в третьем положении кодонов по возможности находились именно они. Это позволяло минимизировать число неспаренных оснований между зондами и искомой ДНК.

Синтезированные зонды использовали для скрининга банка клонов ДНК Corynebacterium·, клоны, гибридизующиеся только с одним из зондов, исключали из дальнейшего рассмотрения, считая, что соответствующая ДНК не является искомой. Выделяли клон, содержащий ген 2,5-DКG-редуктазы, и секвенировали его. Нуклеотидные последовательности, расположенные до стартового кодона ATG, вырезали и заменяли их сигналами транскрипции и трансляции, функционирующими в Е. coli, поскольку регуляторные последовательности грамположительных микроорганизмов типа Corynebacterium spp. не функционируют в клетках этого микроорганизма. Полученную конструкцию вводили в