Рис. 8.8. Компактные приборы для аналогового усиления контраста и цифровой обработки — Leitz Multicon, работающий с легкой твердотельной камерой (А) и Hamamatsu DVS 3000 (Б),

которые являются примерами систем, позволяющих в реальном времени улучшать качество изображения аналоговым и цифровым способами (фотографии любезно предоставлены фирмами Е. Leitz и Hamamatsu Photonics

К. К. соответственно).

1.4.6. Монофункциональные процессоры

Перечисленные выше приборы более или менее многофункциональны, в то же время для работы иногда может требоваться лишь одна или две функции. В этом случае выгоднее бывает приобрести монофункциональные, жестко ориентированные приборы для аналогового усиления, дистанционных измерений, измерений параметра, контроля времени, даты и измерений интенсивности вдоль линии и т. д. Некоторые приборы такого класса поставляются, например, фирмами For-A Company Ltd., Colorado Video Inc.

или Hamamatsu Photonics K. K.

1.4.7. Взгляд в будущее

В ближайшем будущем компьютеры общего назначения (рабочие станции) станут достаточно быстродействующими, чтобы выполнять все большее число функций, требующихся для видеомикроскопии в реальном времени, благодаря уменьшению количества дополнительных приспособлений и расширению программного обеспечения. Параллельно с этим программное обеспечение для анализа изображений, разрабатываемое теми же изготовителями или специализированными компаниями, скоро достигнет такого уровня, что позволит решать часть технических проблем, описанных в разд. 1.4.3 и 1.4.4. Как правило возможности станций намного больше, чем возможности анализаторов изображения, так что на них могут решаться универсальные и рассчитанные на большое число пользователей задачи предварительной обработки, обработки и анализа изображения. Поскольку стоимость таких установок намного больше стоимости приборов, описанных выше, и для их обслуживания будут необходимы специалисты, подобные системы не обсуждаются здесь подробно.

1.5. Условия, налагаемые на микроскоп

Для всех типов видеомикроскопии в качестве основы необходимы микроскопы, относящиеся к категории исследовательских. Многие виды микроскопов могут быть применены для VIM- и VEC-микроскопии.

Во всех случаях применения VIM-метода и в большинстве случаев применения VEC-микроскопии с большим увеличением количество света ограничено. Таким образом, для работы с этими системами важны два условия: оптимизация светособирающей способности микроскопа и достижение эффективной передачи света через оптическую систему.

Светособирающая способность микроскопа прямо зависит от числовой апертуры объектива. Часто приходится учитывать другие факторы, например рабочее расстояние объектива, что заставляет применять специальные объективы с уменьшенной апертурой, но когда возможно, следует использовать объективы с максимальной числовой апертурой. Важность этого момента станет понятна, если рассмотреть, как связаны между собой NA, увеличение и интенсивность света. В системах, где освещающая апертура эквивалентна входной апертуре объектива (как при эпифлуоресценции), интенсивность (7) пропорциональна NA в четвертой степени:

Далее, интенсивность света обратно пропорциональна квадрату увеличения:

162

Сравнивая два объектива Х40 с апертурами 0,9 и 0,5, можно видеть, что светособирающая способность объектива с большей числовой апертурой более чем в 10 раз выше.

Как правило, у объективов одного типа числовая апертура тем больше, чем больше их увеличение. Приведенное выше соотношение прямо указывает на то, что при использовании систем промежуточного увеличения типа «Optovar» или проекционных окуляров следует применять объектив с максимальной числовой апертурой и наибольшим увеличением и промежуточную оптику с минимальным увеличением, поскольку эта оптика не вносит вклада в светособирающую способность системы. Таким образом, если вы стоите перед выбором, использовать ли объектив Х40 в комбинации с окуляром камеры Х10 или объектив Х25 в комбинации с окуляром камеры Х16, то первая система даст намного больший эффект, хотя обе системы имеют конечное увеличение Х400.

Рассматривая второе главное условие, следует помнить, что светопропускание оптической системы в первую очередь зависит от пропускающей способности линз объектива и количества оптических элементов во всей системе. Интересно отметить, что объективы различных конструкций (например, флюоритовые и апохроматы) и изготовленные различными фирмами часто различаются по пропускающей способности, даже в тех случаях, когда по числовой апертуре и увеличению они идентичны. Если это возможно, то рекомендуется проверить несколько объективов применительно к той длине волны (длинам волн), которая будет использоваться.

Втой же, если не в большей, степени имеет значение качество промежуточных оптических элементов. Непросветленные поверхности линз обычно отражают 4—5% падающего на них света. И хотя в исследовательских микроскопах линзы обычно имеют просветляющие покрытия, это не может полностью устранить потерь света при отражении, так что суммарные потери, связанные с прохождением света по всему оптическому тракту, могут быть значительными. Поэтому из оптического пути следует удалить все не являющиеся необходимыми оптические элементы. Если это невозможно, то следует предпочесть микроскоп с более простым оптическим путем.

Втех случаях, когда вы планируете работу с флуоресценцией, убедитесь, что ваша оптика пропускает коротковолновую часть спектра, которая необходима для возбуждения флуоресценции красителей, например свет с длиной волны 340 нм в случае красителя FURA-2, используемого для измерения с помощью видеотехники концентрации Са2+ (разд. 3.3, и рис. 8.12). Требования к оптике иногда предъявляются менее жесткие, так как в большинстве случаев все равно рекомендуется использовать монохроматический свет, и, кроме того, телекамерой захватывается только центральная часть поля зрения (от 1/3 до 1/2 поля, видимого в окуляры). Окуляры с широким полем зрения обычно не дают особых преимуществ.

Если вы планируете работать методом VEC-микроскопии с большим увеличением, то необходимо в большинстве случаев использовать ксеноновую или ртутную лампу, дающую достаточно света, чтобы телекамера могла работать на уровне, близком к уровню насыщения ее динамического диапазона. В некоторых микроскопах даже для VEC-микроскопии с дифференциальным интерференционным контрастом может быть достаточно галогеновой или простой лампы накаливания, если убрать из оптического пути все рассеивающие элементы и установить лампу наилучшим образом. В нашей лаборатории были получены отличные результаты при использовании 50-ваттной ртутной лампы постоянного тока HBO 50W, которая имеет короткую дугу с большой интенсивностью свечения, в комбинации с микроскопом Axiomat (Zeiss); инвертированными микроскопами IM и ICM (Zeiss) или микроскопом Polyvar (Reichert/Cam-bridge Instruments); однако в большинстве случаев были пригодны и 100-, и 200-ваттные ртутные лампы (рис. 8.2, 8.4 и 8.5). Из-за того что после усиления контраста небольшие колебания в интенсивности света лампы могут преобразовываться в хорошо модулированные ярко-белые или черные изображения, очень важно использовать стабилизированный источник питания постоянного тока. Если применяются дуговые лампы, то для получения оптимальных результатов и защиты клеток от синего света желательно использовать узкополосные зеленые интерференционные фильтры (например, для линии ртути 546±10 нм). В этом случае полезно также для защиты интерференционного фильтра, поляризаторов и клеток от тепла и УФ-света использовать по крайней мере по одному из нижеперечисленных фильтров: УФ-фильтр, теплозащитный фильтр, теплоотражающий фильтр.

Для того чтобы уменьшить вибрацию и внутренние движения в микроскопе, происходящие из-за перепадов температуры, рекомендуется устанавливать его на массивную подставку. Это особенно важно в тех случаях, когда используются тяжелые камеры для света низкой интенсивности и наибольшие микроскопические увеличения. Следует помнить, что при типичном для VEC-микроскопии увеличении внутренние перемещения на 1 мкм в препарате эквивалентны перемещениям на экране монитора на 1 см. Поэтому в некоторых случаях могут потребоваться защищенные от вибрации столы.

Способы установки контраста для исследования с помощью видеомикроскопии неокрашенных живых биологических препаратов обсуждаются в разд. 2.5.

1.6. Как соединить телекамеру с микроскопом

Следует удостовериться, что 100% света может быть направлено в телекамеру. Если микроскоп имеет

163

между бинокуляром и гнездом для камеры фиксированный светоделитель, то на его место можно установить зеркало, полностью отражающее свет.

Для видеомикроскопии требуется дополнительное оптическое увеличение. Это связано с тем, что пространственное разрешение в видеоизображении из-за телевизионных линий (развертки) значительно ниже, чем на фотомикрографиях или в тех изображениях, которые дает непосредственно оптика микроскопа. Чтобы полностью использовать разрешение микроскопа, необходимо быть уверенным в том, что лимитирующие его факторы не связаны с видеосистемой. Это означает, что мы должны увеличить изображение препарата на мишени телекамеры намного больше, чем считается достаточным при обычной световой микроскопии. Во всех случаях, когда это возможно, следует использовать объективы с наибольшим увеличением, но когда вы хотите выявить объекты, находящиеся за пределами разрешения, требуется дополнительное увеличение Х4 или Хб,3. Оно может быть достигнуто с помощью системы с переменным увеличением, имеющейся в микроскопах серии Axio (Zeiss), либо систем дополнительного увеличения (типа Optovar, Х2 или больше) и/или фотоокуляров с большим увеличением (Х16 или Х25) в сочетании с проекционной линзой (50— 63 мм), имеющихся в большинстве других микроскопов [например, микроскопах Ш, ICM и серии Axio (Zeiss), Orthoplan и Aristoplan (Leitz), Polyvar (Reichert/Cambridge Instruments)]. В другом случае, можно использовать комбинацию двух.

тубусов с увеличением Х2 или один тубус с увеличением Х4. При компоновке системы следует руководствоваться следующими соображениями: когда размеры объектов равны пределу разрешения или меньше него, а наблюдать их планируется на экране монитора средних размеров, то следует подобрать такое конечное увеличение, чтобы поле зрения монитора имело размер 15—30 мкм или конечное увеличение было около Х8000 — X15 000.

В классическом варианте система, проецирующая изображение на мишень камеры, состоит из окуляра и находящегося в тесном контакте с ним объектива телекамеры (рис. 8.9, А). Оба они состоят из нескольких линз, при этом некоторые поверхности (линз) часто располагаются достаточно близко к плоскости изображения, изза чего в изображении могут появляться дефекты от пыли и несовершенства покрытий линз. Окуляры, однако, являются необходимым элементом во всех случаях, когда коррекция оптических аберраций осуществляется частично в объективе, а частично в окуляре.

Некоторые фирмы-изготовители перешли на объективы с полной внутренней коррекцией аберраций (например, Zeiss,. Reichert/Cambridge Instruments), что дает тем, кто занимается видеомикроскопией, намного больше свободы в использовании различных приставок. В таких оптических системах тубусная линза проецирует промежуточное изображение непосредственно на телевизионную мишень через пустой соединительный тубус (например, в микроскопах серии Axio фирмы Zeiss) (рис. 8.6,5). Это позволяет получать очень хорошие изображения с незначительными дефектами. Для максимального увеличения в такой конструкции требуется дополнительное увеличение от Х4 до Х6,3, создаваемое с помощью телескопа галилеевского типа, установленного в участке параллельного хода лучей, либо с помощью системы дополнительного увеличения (Optovar), либо путем комбинации обеих систем.

Другой способ стыковки, который вызывает мало дефектов изображения, но требует сравнительно много места на оптическом столе, состоит в том, что камеру помещают против бокового выхода микроскопа, установив там сильный окуляр, и промежуточное изображение проецируют непосредственно на мишень камеры. Требуемое увеличение достигается за счет приближения камеры или удаления ее от микроскопа в пределах 10—30 см.

2. Высокое разрешение: видеомикроскопия с усилением контраста

2.1. Различные виды VEC-микроскопии

Видеомикроскопия с усилением контраста изображения, при которой используется светлопольное, темнопольное и косое освещение или флуоресценция, является очень перспективной методикой. Обычно ее называют VEC-микроскопией. Аллен [3, 4] и Иноэ [1] одновременно описали методы видеоусиления контраста при работе с поляризованным светом, которые принципиально различаются, но приводят к очень близким результатам. Чтобы избежать путаницы, необходимо четко различать два предложенных авторами подхода.

Аллен назвал свой метод Алленовским видеоусилением контраста при дифференциальном интерференционном контрасте или поляризационной микроскопии (AVEC-DIC и AVEC-POL соответственно). Согласно этому методу анализатор и поляризатор устанавливаются далеко от положения их скрещивания, что позволяет получить большое отношение сигнал/шум (разд. 1.3.2 [3]). Аллен предложил устанавливать компенсатор Сенармона [3, 4, 15), содержащий четвертьволновую пластинку (подобранную для соответствующей длины волны), которая помещается перед вращающимся анализатором (рис. 8.9,Б). Он рекомендовал задавать смещение задержки он 1/4 до 1/9 длины волны далеко от пика поглощения, отмечая, что сдвиг на 1/9 λ, обеспечивает наилучший компромисс между высоким отношением сигнал/шум и минимальными дифракционными аномалиями. Избыточное количество рассеянного света (Iф), возникающее в результате такой настройки, удаляется за счет соответствующей настройки аналогового или цифрового усиления (разд. 1,3.2).

Метод, рекомендованный Иноэ, который мы в данной главе будем в отличие от предыдущего называть IVEC-микроскопией, имеет своей целью снижение количества рассеянного света и дифракционных аномалий,

164

возникающих из-за кривизны поверхностей линз (табл. 8.1). Он требует применения исключительно высококачественных (свободных от внутренних напряжений) объективов и просветленных линз, разработанных Иноэ [16]. Последние выпускаются только для некоторых микроскопов, например отдельных серий фирмы Nikon, и стоят дорого. В специальном (оптимизированном) микроскопе Иноэ [2, 16] используется установка поляризаторов в положение, близкое к полному поглощению света, эту установку невозможно применять во многих других микроскопах, гак как проходящий при этом свет будет недостаточен для насыщения телекамеры.

AVEC-микроскопия позволяет улучшить малоконтрастные изображения за счет неоптимальной установки оптики, тогда как при IVEC-микроскопии оптика не затрагивается, поэтому для улучшения изображения требуется меньше этапов электронных преобразований. Методом AVEC-микроскопии можно работать на любом хорошем исследовательском микроскопе, снабженном поляризаторами, которые имеются в продаже. Правильную установку компенсатора можно подобрать экспериментально в диапазоне между 1/100 и 1/4 длины волны в зависимости от возможностей вашей осветительной системы. Наилучшее разрешение достигается при смещении на величину, равную 1/9 длине волны [17], а наилучшая визуализация (наивысший контраст) — при смещении задержки на величину в 1/15 длины волны на некоторых микроскопах [18]. Согласно Аллену, размеры объекта, видимые при последнем способе установки света, будут различными в зависимости от его ориентации по причине дифракционных аномалий [3, 4].

Рис. 8.9. А. Установка для видеомикроскопии, которой авторы пользовались для временной работы в морской биологической лаборатории. Слева направо: камера типа Chalnicon расположена у нижнего выхода инвертированного микроскопа Zeiss IM 405. Использованы окуляр Х25 и проектив с фокусным расстоянием 63 мм (для постоянной установки рекомендуется сделать более основательный штатив телекамеры). Микроскоп оснащен лампой накаливания и 50-ваттной стабилизированной ртутной лампой для проходящего света, а также дуговой 100-ваттной ртутной лампой для эпифлуоресценции. В держатель для флуоресцентных фильтров вставлен четвертьволновый компенсатор Сенармона (на фото не виден). Монитор для выведения обработанного изображения расположен позади клавиатуры видеопроцессора Hamamatsu С 1966. Второй монитор, дающий прямое изображение (используется для фокусировки), расположен поверх видеопроцессора. В правом углу: цветной монитор для получения псевдоцветного изображения и фотографирования; видеомагнитофон U-типа. Б. Детали встроенного в микроскоп Zeiss Axiophot устройства с компенсатором Сенармона для AVEC-DIC-микроскопии. 1— объективная призма Волластона; 2— четвертьволновая пластинка; 3 — система промежуточного увеличения с коэффициентом 1,6; 4 — вращающийся поляризатор со шкалой, который используется как анализатор; 5 — система дополнительного увеличения Х2,5. В такой системе для присоединения телекамеры можно использовать пустой тубус (рис. 8.6,5). Поляризатор и призма Волластона в конденсоре не видны.

2.2. Приготовление препаратов

Препараты, используемые в обычной световой микроскопии, могут использоваться также и для видеомикроскопии. Для наблюдения живых культивируемых клеток желательно выращивать культуры на покровных стеклах — так можно получить наилучшие изображения. Если применяются большие увеличения, то может оказаться, что оптика позволяет установить правильное освещение по Кёлеру только на поверхность

165