последней стадии антитела, адсорбированные на коллоидном золоте. Иммунохимические методы с использованием коллоидного золота являются высокочувствительными. С их помощью можно проявить даже самое слабое фоновое окрашивание. Прежде чем применять эти вторые антитела, срезы необходимо проинкубировать 10 мин в нормальной сыворотке животного того же вида.

Для проявления окраски.

1.Промойте препарат в воде.

2.Проинкубируйте его в растворе серебряного усилителя при неактиничном освещении (например, используя освещение для работы в темной комнате).

3.Промойте препарат в воде.

4.Докрасьте препарат. Проведите его через этанол и ксилол и заключите. Раствор серебряного усилителя 20 мл 1 М цитратного буфера (1 М лимонная кислота, 0,5 М трехзамещенный цитрат натрия), рН 3,5; 33 мл 30%-но-го гуммиарабика с 15 мл лактата серебра (0,11 г в 15 мл); 15 мл гидрохинона (0,85 г в 15 мл); 17 мл воды.

6.8.Иммуноцитохимия с использованием коллоидного золота

Коллоидное золото выявляется в результате осаждения серебра при химическом процессе, сходном с тем, который используется при проявлении фотопленки. Если ткань была фиксирована формалином и заключена в парафин, то следует предварительно обработать срезы раствором Люголя или каким-либо другим окислителем [10]. Такая обработка по неизвестной пока причине необходима, хотя при других условиях фиксации и подготовки препаратов она не нужна. Соответствующая методика приведена в табл. 4.12.

6.9. Некоторые общие процедуры

6.9.1. Покрытие предметных стекол

При иммуногистохимическом окрашивании стекла многократно промывают. Поэтому необходимо, чтобы срезы были плотно прикреплены к ним. Существует несколько различных методик нанесения на стекла покрытия, позволяющего улучшить адгезию. Четыре такие методики, обычно используемые в на шей лаборатории (желатина—формальдегид, желатина, альбумин и поли-L-лизин), а также условияих применения даны в табл. 4.13.

Таблица 4.13. Растворы, применяемые для покрытия предметных стекол

A. Желатина—формальдегид. Часто используется при работе с замороженными срезами.

1.Смешайте 100 мл 1%-ной желатины (ее предварительно надо слегка подогреть, чтобы она растворилась) и 100 мл 2%-ного формальдегида.

2.Погрузите стекла в раствор на 3 секунды и дайте им высохнуть на воздухе.

3.Храните их при комнатной температуре и используйте по мере необходимости.

Б. Другая смесь на основе желатины. Иногда используется для замороженных и залитых в мягкую среду срезов.

1.Разведите 15 г желатины в 500 мл теплой воды.

2.Растворите 1 г алюмохромовых квасцов в 220 мл дистиллированной воды.

3.Смешайте два раствора, затем добавьте 70 мл ледяной уксусной кислоты и 300 мл 95%-ного этанола.

4.Храните смесь при комнатной температуре.

5.Покройте стекла, как указано в А, этап 2.

B. Альбумин. Обычно используется для срезов, залитых в парафин.

1.Растворите 2,5 г яичного альбумина и 0,25 г NaCl в 50 мл дистиллированной воды (нагреть до 37 °С).

2.Добавьте 50 мл глицерола и 0,05 г тимола.

3.Покрывайте стекла непосредственно перед употреблением.

Г. Поли-L-лизин.

1.Погрузите стекла в водный раствор (100 мкг/мл) поли-L-лизина с высоким молекулярным весом

(Sigma).

2.Высушите и храните.

3.Для стекол, которые будут окрашиваться при реакции гибридизации ДНК in situ, концентрацию поли-L-лизина нужно увеличить до 1 мг/мл (табл. 4.14).

87

6.9.2. Дополнительное окрашивание

Широко применяется докрашивание ядер, позволяющее выявить архитектуру ткани. Если при иммуногистохимической реакции образуется красная, коричневая или черная окраска, то для дополнительного окрашивания обычно применяется гематоксилин или гемалаун Майера. Мы пользуемся последним. Если при иммуногистохимической реакции образуется синяя окраска, то для докрашивания лучше пользоваться метиловым зеленым.

Гемалаун Майера.

1.Растворите 1 г гематоксилина в 1 литре дистиллированной воды при умеренном нагревании.

2.Добавьте 50 г алюмо-калиевого сульфата и нагрейте, если это необходимо.

3.Добавьте 0,2 г иодата натрия, хорошо перемешайте и оставьте на ночь.

4.Добавьте 1 г лимонной кислоты, хорошо перемешайте.

5.Добавьте 50 г хлоралгидрата.

6.Погрузите стекла с препаратами на 5—20 мин в гемалаун (время окраски зависит от того, какую интенсивность ее вы хотите получить); затем тщательно промойте в проточной воде.

7.Погрузите препараты в насыщенный раствор карбоната лития, который придаст окраске синий цвет; затем промойте в проточной воде.

Метиловый зеленый.

Для окраски используется 0,1% раствор метилового зеленого в дистиллированной воде. Поскольку краска растворяется в воде, для заключения препаратов нужна безводная заливочная среда.

6.9.3. Заключение препаратов под покровные стекла

Если продукт реакции нерастворим в спирте и ксилоле, то препараты после окраски проводят через спирты в ксилол. Покровные стекла приклеиваются натуральной или синтетической смолой типа DPX. Если осадок растворяется в спирте или ксилоле, то препараты оставляют в воде и покровные стекла монтируют на них, используя глицероловое желе или сходную водорастворимую смесь.

DPX состоит из 10 г дистрена, 80,5 мл дибутилфталата и 35 мл ксилола. Обычно он продается готовым к употреблению.

Для изготовления глицеролового желе:

1)растворите 10 г желатины в 60 мл дистиллированной воды при умеренном нагревании;

2)добавьте 70 мл глицерола и 0,25 г фенола и хорошо перемешайте;

3)разлейте на аликвоты по 10 мл и храните на холоде;

4)перед употреблением нагрейте на водяной бане; избегайте встряхивания, так как это приведет к появлению пузырьков воздуха.

7. Решение возникающих проблем с помощью контрольных препаратов

При проведении иммуногистохимических реакций возникают два типа проблем: с одной стороны, появление нежелательной окраски и, с другой стороны — неожиданное отсутствие окраски. Эти проблемы решаются путем постановки соответствующих контролей.

7.1. Контрольные препараты

Необходимо делать контрольные препараты двух видов — положительный и отрицательный контроли. При использовании каждого антитела необходимо выбрать блок ткани, заведомо содержащий данный антиген, и сделать с него большое количество срезов. Один из них будет использоваться в каждой окраске для того, чтобы по нему определять интенсивность реакции окрашивания.

При каждой окраске в числе препаратов должен также быть препарат исследуемой ткани, на который при постановке реакции не были нанесены первые антитела. Это нужно для проверки на неспецифическое окрашивание, которое могут давать реагенты, используемые для выявления первых антител. Если применяется прямой метод окраски, то данный контроль можно пропустить. При ферментативном методе выявления антител в качестве контроля применяется препарат, на котором для проверки активности эндогенных ферментов ставится только сама цветная реакция.

Вышеуказанные контроли, хотя и являются необходимыми, не позволяют выявить неспецифическое связывание первых антител. При использовании поликлональных антител для этого можно взять их аликвоту и истощить антитела исходным антигеном. Это позволяет уменьшить специфическое окрашивание и обнаружить неспецифическое окрашивание, однако не позволяет выявить эпитопы. Данный контроль не обязательно ставить при каждом окрашивании, но если антиген легко доступен, то контроль надо поставить на одном-двух препаратах при первом использовании новой антисыворотки. Применительно к моноклональным антителам этот тип контроля не имеет смысла. Тестовый препарат может служить контролем сам по себе. Распределение

88

антигена в нем скорее всего известно: например, антитела к Т-лимфоцитам не будут окрашивать эпителиальные клетки. Нужные структуры в нем будут хорошо окрашены, а все остальные останутся прозрачными. Если у вас окрасились «неправильные» клетки, то это дает основание подозревать наличие неспецифического связывания. В частности, «грязный» фон на препарате при недостаточной отмывке дают мышечные клетки стромы.

7.2. Решение проблем

При решении возникающих проблем нужно исходить из простой логики. Описанные выше контроли должны указывать на' то, в какой части процедуры присутствует ошибка. Вам в свою очередь следует тщательно проверить каждый шаг. Часто источником трудностей является какая-нибудь мелочь. Желательно, например, использовать предметные стекла, матированные с одной стороны, и четко помечать их карандашом. Без этого бывает иногда трудно отличить одну поверхность предметного стекла от другой, и таким образом, можно окрасить не ту сторону.

Существует три типа неправильного окрашивания: недостаточное, избыточное и неспецифическое окрашивание. Полное отсутствие окраски на положительном контрольном препарате часто указывает на то, что был случайно пропущен реактив или было взято не то вещество. Если окрашивали одновременно много срезов с использованием различных антител, то, вероятно, ошибка относится ко второму антителу, которое использовали в данной окраске (например, взяли антикроличьи антитела при окраске срезов мышиными антителами).

Слабая окраска указывает на то, что один из наиболее лабильных реактивов был испорченным. Например, при использовании окрашивания пероксидазой необходим свежий раствор Н2О2. Для предотвращения роста бактерий в буферных растворах к ним часто добавляют азид натрия. Азид ингибирует многие ферменты, так что использование буфера с азидом может вызвать трудности при проведении реакции с хромогеном.

Избыточное окрашивание часто является следствием ошибки в разведении одного из реактивов. Проблемы могут возникать также из-за температуры. Большинство исследований проводятся обычно при комнатной температуре, которая в помещениях, где нет кондиционера, может различаться на 10 °С. Скорость ферментативных реакций резко возрастает с увеличением температуры, так что методика окрашивания, разработанная в холодный день, может привести к образованию избыточного цветного продукта в жаркую погоду.

Если объем раствора антител недостаточен для того, чтобы как следует покрыть срезы, то следует помнить, что любое испарение во время инкубации приведет к повышению концентрации антител в срезе, что приведет к избыточному окрашиванию. В предельном случае, если раствор на части срезов полностью высох, появится интенсивное фоновое окрашивание.

Избыточное окрашивание приводит к усилению неспецифического окрашивания. Кроме того, если данная проблема возникает постоянно, то следует обратить особое внимание на процедуры, связанные с отмывкой препаратов, в частности на возможное присутствие белка в буфере. Если трудности возникают на стадии применения первых антител, то можно попробовать предварительно инкубировать срезы в течение 15 мин в растворе ФСБ, содержащем 5% сыворотки .от другого вида животного (сноска к табл. 4.10). Если трудности возникают при применении препарата вторых антител, то его следует заменить, взяв препарат, полученный из другого источника.

8. Совместное определение двух антигенов на одном срезе

Совместное применение двух антител на одном и том же срезе требует особых предосторожностей. Если антитела были получены от животных разных видов, то можно воспользоваться непрямым методом с двумя поразному маркированными вторыми антителами, предварительно отобранными так, чтобы между ними не было перекрестной реакции. Если два первых антитела получены от одного животного, что при работе с мышиными моноклональными антителами встречается часто, то можно провести полное иммуногистохимическое окрашивание сначала на первый антиген, а затем такое же окрашивание на второй антиген, используя различные ферменты (образование окрашенного осадка часто препятствует взаимодействию первого антитела со вторым набором реактивов). Если данный метод не работает, то следует либо воспользоваться прямым методом, когда к каждому антителу присоединяется его собственная метка, либо присоединить к каждому антителу отличающую его молекулу. Например, одно антитело может быть биотинировано и затем выявлено с помощью авидина, а второе соединено с ДНФ и выявлено антителами к ДНФ.

Правильный порядок применения реактивов должен быть установлен эмпирически. Если используются антитела от различных видов животных, то можно достичь хороших результатов, применяя одновременно оба первых, а затем оба вторых антитела, и теоретически такая схема всегда будет работать хорошо. Однако иногда лучшие результаты получаются, если реактивы используют последовательно.

Ферментные метки дают удовлетворительные результаты, если два антигена располагаются на разных клетках (например, когда необходимо различить два трансплантационных антигена у химерной мыши), либо в разных клеточных компартментах (например, ядро и плазматическая мембрана). Если этого нет, то трудно бывает с уверенностью отличить единично и дважды меченные клетки. В этом случае надо воспользоваться флуоресцентными метками и микроскопом, который позволяет оператору быстро переключать комбинации

89