7,3.

2.Нанесите 100 мкл раствора на срез.

3.Поместите срезы на предварительно нагретом металлическом поддоне в сушильный шкаф, установленный на температуру 95 °С*, и оставьте на 8 мин.

4.Перенесите во влажную камеру и оставьте на ночь при 42 °С.

5.Проинкубируйте в растворе 2XSSC в течение 30 мин при комнатной температуре.

6.Проинкубируйте в растворе 0.1XSSC в течение 45 мин при 42 °С, сменив буфер через 30 мин.

* Поскольку стекла со срезами разогреваются не мгновенно, то в течение этих 8 мин их температура будет ниже указанной. Оптимальную температуру сушильного шкафа надо подобрать эмпирически.

Часто для мечения ДНК используется процесс, называемый ник-трансляцией (от английского nick — разрезать). В присутствии ДНК-полимеразы и четырех нуклеотидтрифосфатов (один из которых содержит метку) в одну из цепей ДНК с помощью фермента вносятся разрывы. Полимераза восстанавливает заново одну цепь ДНК, используя неповрежденную в качестве матрицы.

Детальное описание техники рекомбинирования ДНК можно найти в работе [11], а также в трех других книгах из настоящей серии (DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I, II и 111, D. M. Glover, ed.).

Для гистохимических целей ДНК может быть помечена изотопом и выявлена с помощью радиоавтографии. В некоторых случаях получаемое с помощью радиоавтографии разрешение недостаточно высоко; кроме того, радиоавтография часто дает большой фон, и процесс экспозиции занимает до недели и более. Введение в ДНК биотина позволяет воспользоваться иммуногистохимическими методами. Они более быстрые и позволяют лучше определять локализацию исследуемого вещества, хотя в настоящее время данные методы менее чувствительны, чем радиоавтография.

9.2. Экспериментальная процедура

Весь метод распадается на три части — мечение ДНК, используемой в качестве зонда, биотином, гибридизация пробы на срезе и визуализация гибридных молекул. Мечение ДНК биотином обычно выполняется с помощью ник-трансляции в присутствии биотин-11-дезоксиуридинтрифосфата (его можно приобрести у фирмы BRL—Gibco), который используется ДНК-полимеразой вместо тимидинтрифосфата. В частности, если проводятся пробы на геномную ДНК, то количество биотина, связавшегося со срезом, может быть очень маленьким. Для его определения необходимо воспользоваться чувствительными методами, которые могут включать использование нескольких слоев антител.

В нашей лаборатории мы успешно использовали для выявления человеческой Y-хромосомы и ДНК цитомегаловируса опубликованный Барнсом с соавт. [12] метод в модификации Палетта (С. D. Palett, Institute of Cancer Research). Некоторые другие примеры использования рекомбинантной ДНК, в которых определяли мРНК, описаны в литературе [13, 14].

9.2.1. Выявление Y-хромосомы

Специфическую ДНК Y-хромосомы вместе с набором реактивов для ник-трансляции можно приобрести у Amersham International и пометить согласно инструкциям фирмы. Препарат очищают с помощью хроматографии на колонке с сефадексом G-50 (Pharmacia), уравновешенным раствором, содержащим 0,1 M NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% (объем на объем) додецилсульфата натрия, 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4.

На каждый микролитр маркерной ДНК добавляют 500 мкг ДНК спермы лосося и 2 объема охлажденного на льду этанола. Чтобы осадить ДНК, смесь оставляют на ночь при —20 °С, затем центрифугируют, супернатант отсасывают и оставшийся этанол выпаривают в вакууме. ДНК вновь растворяют в среде, содержащей 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4, разливают на аликвоты и хранят в замороженном виде.

Таблица 4.16. Определение биотинированной ДНК в пробе

1.Дважды промойте срезы

2.Проинкубируйте их с щелочной фосфатазой, конъюгированной с авидином (Daco) и разведенной 1 :

100.Промойте.

3.Проинкубируйте с биотином (1 мг/мл). Промойте.

4.Проинкубируйте с козьими антителами к биотину (Sigma) в разведении 1 : 50. Промойте.

5.Проинкубируйте с кроличьими антителами против Ig козы, конъюгированными с щелочной фосфатазой (Sigma, разведение 1 : 100). Промойте.

6.Проинкубируйте с козьими антителами против Ig кролика, конъюгированными с щелочной фосфатазой (Sigma, разведение 1 : 100). Промойте.

7.Повторите этап 5.

8.Проведите цветную реакцию на щелочную фосфатазу с использованием быстрого красного TR (разд. 6.5).

9.Слегка докрасьте гемалауном Майера и заключите в глицероловое желе.

Все инкубации и промывки надо проводить в 0,1% растворе БСА на ФСБ. Время всех инкубации — 1

91