информацию об очень тонких особенностях исследуемого образца.

Если вы берете новый поляризатор, то плоскость его пропускания необходимо отметить. Как это сделать, указано в табл. 1.4 и проиллюстрировано на рис. 1.3.

2.5. Дифракция

Дифракция — явление не столь очевидное, как описанные выше взаимодействия света с веществом. Однако она имеет фундаментальное значение для микроскопии. Некоторые эффекты дифракции проявляются и при обычных условиях наблюдения, однако в общем считается, что свет распространяется прямолинейно и тени должны иметь резкие границы. Дифрагированный свет, как правило, значительно слабее прямого, и не заметен при обычном наблюдении.

Рис. 1.3, Метод определения разрешенной плоскости колебаний для кусочка поляроида. См. табл. 1.3

Несколько простых примеров, иллюстрирующих явление дифракции, приведено в табл. 1.5—1.7. Цель приведенных примеров — привлечь внимание исследователей к тому факту, что видимое в микроскопе изображение — это только репродукция образца, но не сам образец. К точности копирования обычно относятся скептически, например, в скульптуре или живописи. Такое же критическое восприятие должен усвоить тот, кто работает с микроскопом. Дело в том, что при любом копировании качество копии определяется количеством информации об исходном предмете и зависит, таким образом, от совершенства используемого метода или прибора.

Таблица 1.5. Демонстрация рассеяния света препаратом

1.Возьмите любой хорошо окрашенный препарат, содержащий мелкие детали. Одним из препаратов такого рода может служить срез кожи, окрашенный по Массону для выявления трихомов.

2.Посмотрите на него в микроскоп при почти полностью закрытом конденсоре. Обратите внимание на размытые детали на границах мелких структур. Это эффект дифракции.

3.Выньте окуляр из микроскопа (или замените окуляр на телескоп, который используется как фазовое устройство). В центре будет яркий диск с размытыми границами, окрашенный в основной цвет препарата. Вводя и выводя препарат из поля зрения объектива, заметьте, что размытость границ, появляется только в присутствии препарата. Интенсивность нерезкого окаймления примерно такова, что компенсирует потерю интенсивности освещения центрального диска в присутствии препарата. Размытое окаймление — это рассеянный свет. Рассеяние происходит в основном вследствие дифракции, вызываемой препаратом. Необходимо снова отметить, что объектив собирает как свет центрального диска, так и часть рассеянного света. Это будет лучше заметно, если диафрагму конденсора закрыть более плотно, а также в тех случаях, когда образцы обладают собственной периодичностью. В следующем упражнении с помощью специально разработанного препарата будет продемонстрирована необходимость дифракции для формирования изображения.

Приведенные выше примеры могут быть продемонстрированы при правильно установленном освещении по Кёлеру. В тех случаях, когда диафрагма конденсора не позволяет получить достаточно узкий пучок света, ее в какой-то степени можно заменить полевой диафрагмой, закрывая последнюю.

11

2.5.1. Тестовые пластинки Аббе

Эксперименты с дифракционными пластинками Аббе или иными дифракционными образцами чрезвычайно интересны. Они позволяют наглядно сравнить видимое изображение с тем,. что проходит через з.ф.п. объектива.

Для детального описания роли дифракции в построении изображения в микроскопе здесь нет возможности. Более подробное изложение данного вопроса приводится в работе [2].

Аббе (Abbe) впервые создал теорию построения изображения в микроскопе. Схема его экспериментов приведена в табл. 1.6. Тестовые пластинки Аббе выпускала фирма Zeiss, однако недавно производство их прекратилось. Если у вас в лаборатории есть такая пластинка, то вы можете поэкспериментировать с ней, а если ее нет, то можно использовать такой препарат, как дифракционные решетки, выпускаемые Graticules Ltd. Можно воспользоваться также биологическими препаратами, такими, как чешуйки крыльев бабочек (прямые полоски) или фасеточные глаза насекомых (сеточка). Похожая на последний препарат, но значительно более мелкая гексагональная исчерченность имеется на панцирях диатомовой водоросли Pleurosigma angulatum (табл. 1.7).

Таблица 1.6. Эксперименты с дифракционной пластинкой Аббе (см. рис. 1.4)

А. Препарат, дифракция, объектив.

1.Установите пластинку Аббе в положение, при котором темные полосы чередуются с прозрачными (дифракционная решетка). Рассмотрите ее в микроскоп при закрытой до малого отверстия диафрагме конденсора (рис. 1.4, Л I).

2.Выньте окуляр и с помощью фазового телескопа рассмотрите заднюю поверхность объектива. На ней вы увидите дифракционную картину из цветных пятен (спектр) по обе стороны от яркого центрального диска (рис. 1.4, Л II).

3.Вращайте препарат, наблюдая при этом за изменением направления дифракционной картины.

4.Обратите внимание на относительные интенсивности дифракционных пятен, а также на то, что синие части в каждом спектре расположены ближе к центру, чем красные.

5.Из того, что было видно в з. ф. п., сделайте заключения об угле и направлении дифракции света препаратом, а также о собирающей способности объектива.

Б. Определение значения различных компонентов дифрагированного света для формирования изображения.

1.В з. ф. п. объектива могут быть помещены различные экраны. Здесь рассматриваются два таких экрана, но можно изготовить и другие экраны из круглых покровных стекол подходящих размеров или маленьких дисков непрозрачного материала.

а) Поместите в з. ф. п. объектива небольшой экран в виде шайбы, как описано в разделе А. Сделайте апертуру шайбы достаточно маленькой, чтобы она препятствовала прохождению дифрагированного света через объектив.

б) Вставив окуляр, убедитесь, что детали изображения решетки не видны. Это можно объяснить только тем, что отсутствует дифрагированный свет.

в) Убедитесь, что без дифрагированного света яркий центральный диск не может дать изображения препарата и что только при наличии дифрагированного света можно получить изображение. Если первый порядок дифракции не участвует в формировании изображения, то микроскоп не в состоянии разрешить линии решетки.

г) Изготовьте экран подходящих размеров с тремя щелями и поместите его в з. ф. п. объектива для того, чтобы ее вид изменился с рис. 1.4, и на рис. 1.4, 5 II .

д) Вернувшись к изображению, обратите внимание, что оно теперь содержит линии, расположенные значительно плотнее (рис. 1.4,5II), чем в исходном изображении (рис. 1.4,5I).

2.Поверните пластинку Аббе так, чтобы появились скрещенные линии (рис. 1.4, 5 I). Рассмотрите з. ф.п. объектива, как описывалось ранее. Обратите внимание, что дифракционные спектры расходятся от центрального светлого диска по крайней мере в трех направлениях (рис. 1.4,5III).

3.Поместите экран со щелями в з. ф. п. объектива таким образом, чтобы проходил дифракционный спектр только одного направления (рис. 1.4,51V). Вставьте окуляр и посмотрите на новое изображение (рис. 1.4, В IV). Вы увидите, что оно резко отличается от исходного: вместо сеточки из пересекающихся линий вы увидите серию параллельных линий, идущих перпендикулярно направлению спектра, прошедшего через объектив. Как следует из этапов 1 и 3, от того, проходит ли дифрагированный свет через з. ф. п. объектива, зависит появление деталей изображения.

Таблица 1.7. Заменители пластинки Аббе

12

Любой препарат, содержащий мелкие повторяющиеся детали, дает возможность выполнить эксперименты, близкие к описанным Аббе. Одна обычно доступная в лабораторных условиях комбинация приведена здесь.

1.Настройте микроскоп, чтобы наблюдать в нем диатомовую водоросль P. angulatum.

2.Используйте масляно-иммерсионный объектив с апертурой 1,3 и диафрагмой в з. ф. п.

3.При открытой диафрагме в з. ф. п. можно видеть гексагональную структуру панциря диатомовой водоросли. Закройте диафрагму и убедитесь, что рисунок исчез.

4.Вновь откройте диафрагму в з. ф. п. и убедитесь, что картина восстановилась. Закрывайте диафрагму конденсора, следя за тем, чтобы картина сохранилась.

5.Выньте окуляр и, рассматривая з. ф. п., убедитесь в наличии дифракционной картины, которая имеет вид яркого центрального пятна, и дифракционных спектров, расходящихся от него в трех направлениях, причем их максимумы находятся вблизи границ з. ф. п. (рис. 1.6, Л). Наблюдайте эффект открывания и закрывания диафрагмы в з. ф. п. и, наконец, закройте ее так, чтобы в з. ф. п. не было видно спектра первого порядка (рис. 1.6, Б). Вставьте окуляр и посмотрите, что стало с изображением (рис. 1.6,Г). Вновь откройте диафрагму в з. ф. п., и детали изображения опять появятся (рис. 1.6,5).

6.Исходя из результатов установки диафрагмы в з. ф. п., можно заключить, что для появления гексагонального рисунка необходимо, чтобы свет первого порядка проходил через з. ф. п. объектива. Микроскоп не в состоянии разрешить детали изображения, если он не может собрать дифрагированный свет первого порядка.

7.Данное упражнение можно повторить с темнопольным конденсором, что позволит продемонстрировать роль света нулевого порядка в построении изображения (гл. 2, разд. 4.2). Чтобы подытожить обсуждение того, как соотносятся препарат, численная апертура и з. ф. п. с качеством и детальностью изображения, еще раз обратитесь к тексту.

Для наблюдения этих заменяющих препаратов необходимы соответствующие объективы. Так, например, для наблюдения чешуек бабочек и диатомовых водорослей требуется NA около 1,3, тогда как для: глаз насекомых достаточно объективов с NA около 0,17.

Понимание того, как формируется изображение в микроскопе, необходимо, чтобы оценить, насколько изображение является удовлетворительной копией наблюдаемого препарата. Упражнения, предлагаемые в табл. 1.6 и 1.7, показывают, что в конечном счете разрешающая способность объектива, которая с практической стороны обсуждается в разд. 2.5.3, обусловлена его способностью собирать дифрагированный свет.

Стадии формирования изображения в микроскопе могут быть выведены из последовательных шагов, приведенных в табл. 1.6, Л.

1.На первом этапе устанавливается соответствие между изображением и образцом: изображение есть увеличенная версия образца, в данном случае линий, протянувшихся в направлении север — юг.

2.На втором и третьем этапах выясняется, что образец рассеивает свет за счет дифракции в направлении, перпендикулярном линиям, но параллельном направлению чередования светлых и темных участков в препарате. Объектив собирает часть дифрагированного света и пропускает его через себя. То, что собрано объективом, видно в качестве серии дифракционных спектров в з. ф. п.

3.Заметьте, что синий свет отклоняется под меньшим углом по сравнению с красным, то есть он оказывается ближе к центру недифрагированного света. Положение и характер дифракционных максимумов в з. ф. п. определяет то, что мы называем оптическим преобразованием образца.

Данные положения могут быть изложены математически с помощью уравнения для угла отклонения дифракционного максимума (θ) в зависимости от собирающей силы объектива (NA).

Для каждого порядка дифракции угол 9 вычисляется па уравнению

где θ — угол дифракции, λ — длина волны света, а х — расстояние между линиями. Буква i обозначает номер порядка. Так, для дифракции третьего порядка угол (sin θ3) будет в три раза больше, чем для дифракции первого порядка (sinθ1).

Если числовая апертура, которая равна n * sin α, будет больше, чем sin θ1 то лучи, отклоненные под углом θ1 будут собраны объективом, и это будет видно по наличию спектра в з. ф. п. объектива.

Данные эксперименты могут быть повторены и с другими дифракционными решетками. Чем больше номер решетки, тем меньше будет значение х в уравнении (1) и тем больше спектр будет удален от центра.

Если в з. ф. п. объектива рассматривать решетку из перекрещенных линий (рис. 1.4,БIII), то можно видеть, что по диагоналям дифракционные максимумы располагаются не совсем там, где им положено быть в случае, если линии решетки перпендикулярны.

Картину, возникающую в з. ф. п. объектива, иногда называют Фурье-преобразованием препарата, которое осуществляется цугами световых волн.

Следующий шаг в понимании того, как получается изображение,— это определение роли каждого порядка дифракции в формировании изображения.

13

Рис. 1.4. Эксперименты с тестовой пластинкой Аббе или другими тестовыми решетками. Л. I. Линии на препарате с шагом х. А. II. Поперечные линии на препарате с шагом х. Б. Задняя фокальная плоскость с щелевым экраном и без него. В. Изображения препаратов с щелевыми экранами в з. ф.п. и без них. Стрелки указывают на изменения в з. ф. п. и взаимоотношения изображений с з.ф. п.

Практические иллюстрации приведены в табл. 1.6,5, где предполагается, что каждый спектр в з. ф п. является вершиной конуса света, выходящего из задней линзы объектива (рис. 1.5). Перекрывая соответственно прохождение отдельных порядков дифракции, можно определить роль каждого из них в построении изображения.

В табл. 1.6,5 рассмотрены первый и более высокие порядки дифракции. Значение нулевого порядка более подробно обсуждается в связи с факторами, влияющими на контраст. Эксперименты, объясняющие это, даны в табл. 2.8 (гл. 2).

Поскольку тестовые пластинки Аббе больше не выпускаются промышленностью, то для демонстрации этого явления могут быть использованы заменяющие их препараты, которые можно найти в большинстве биологических лабораторий. В табл. 1.7 приведены инструкции по использованию такого препарата, а рис. 1.6 иллюстрирует последовательные этапы -его наблюдения.

Табл. 1.6 и 1.7 описывают лишь некоторые эксперименты, которые могут быть выполнены с простейшими приспособлениями и приводятся здесь для того, чтобы проиллюстрировать основные моменты в формировании изображения в микроскопе.

Рис, 1.5. Формирование изображения в световом микроскопе. Основные этапы указаны на рисунке справа. Они показывают, что ограничения

при использовании микроскопа в основном определяются способностью объектива собирать свет, выходящий из образца. На рис. 1.5 процесс формирования изображения представлен графически, и указаны его последовательные этапы.

2.5.2. Формирование первичного изображения

Образец освещается цугами световых волн и рассеивает часть этого света различными способами, включая дифракцию. Направление и угол дифракции определяются направлением и степенью периодичности образца. Можно различить определенное число дифракционных максимумов, включая нулевой порядок (светлый центральный диск) и спектр первого порядка.

14