Таблица 3.1. Комплементарные цвета

Такое размещение позволяет избежать того, что отпечатки пальцев, пылинки и другие загрязнения поверхности фильтра будут видны одновременно с изображением препарата. Устройство многих микроскопов как бы приглашает пользователя расположить светофильтр в том отверстии в основании микроскопа, через которое идет свет, т. е. под конденсором. На этом уровне светофильтр окажется близко к полевой диафрагме микроскопа, которая находится в плоскости, сопряженной с препаратом и с конечным изображением, так что загрязнения светофильтра могут влиять на изображение. Нужно стараться избегать возникающих в связи с этим проблем. Резюмируя, можно дать следующие советы.

1.Узкополосный светофильтр, например Wratten 58, или зеленый интерференционный светофильтр, следует всегда использовать для улучшения оптических характеристик микроскопа, кроме тех случаев, когда они значительно влияют на контраст.

2.Следует избегать зеленых красителей, поскольку их будет трудно различить при использовании зеленых светофильтров. Лучше применять пурпурные или красные красители, дающие хороший контраст в зеленом свете.

3.Если применяются сильно окрашенные светофильтры, то может потребоваться корректировка данных о чувствительности пленки, вводимых в экспонометр, поскольку спектральная чувствительность светоизмерительной системы в фотокамере вряд ли точно совпадает с таковой пленки. Это следует проверить с помощью пробной пленки (разд. 11.2).

8.3. Цветная фотомикрография

Запись цветного изображения основана на том, что любой цвет может быть воспроизведен при помощи соответствующей смеси трех основных цветов — красного, зеленого и синего. Современные общеупотребительные цветные пленки содержат три сдоя эмульсии, каждый из которых чувствителен к одному из основных цветов. В большинстве пленок эти слои содержат молекулы — предшественники красок соответствующих цветов. Краска образуется, когда эти молекулы взаимодействуют с продуктами окисления специального проявителя, получающимися в процессе его взаимодействия с галогенидом серебра. Само серебро в дальнейшем растворяется и удаляется.

8.3.1. Цветные отпечатки или слайды

Цветные пленки могут быть предназначены либо для получения негативов, с которых можно сделать отпечатки на бумаге (негативные пленки), либо для получения слайдов для проецирования (обратимые пленки). Фотомикрографии в виде отпечатков очень удобны, так как их легко представлять на стендах, в статьях, в диссертациях и т. д. Обратимые пленки необходимы для использования на лекциях, но этим только отчасти объясняется огромная популярность таких пленок среди микроскопистов. Существует несколько отличных способов получать отпечатки со слайдов. Благодаря этим способам обратимая пленка, с точки зрения опытных исследователей, занимающихся фотомикрографией, более всего подходит для работы с микроскопом.

Многие из тех, кто работает с микроскопом и хотел бы делать отпечатки, знакомы с быстрыми и дешевыми услугами фотолабораторий, которые стали теперь доступны. Поскольку полученные с их помощью результаты обычно разочаровывают, то здесь необходимо дать краткое объяснение возникающих трудностей. К сожалению, при использовании имеющихся в продаже стандартных проявителей достичь наивысшего качества на негативной пленке значительно труднее, чем на позитивной. Обратимая пленка проявляется в стандартизованных и точно контролируемых условиях, и конечный слайд — это именно тот кусочек пленки, который экспонировался в фотокамере; при соответствующей обработке конечный результат представляет собой полноценную запись попавшего на пленку изображения. При использовании негативной пленки добавляется еще один процесс — печать на фотобумаге, и именно здесь могут возникать отклонения в цветах.

Большинство проявляющих лабораторий, обслуживающих массовый рынок, использует технику, которая автоматически, вводя в ход лучей светофильтры, компенсирует то, что она принимает за искажение цветового баланса. Для бытовой фотографии этот автоматический способ работает хорошо, так как в «средней» фотографии имеется примерно равное распределение трех основных цветов. Это допущение, на котором основано действие автомата, в общем виде несправедливо для фотомикрографий, где детали изображения могут быть окрашены лишь в один или два цвета и часто располагаются на белом фоне. В связи с этим возникают проблемы. Например, если окрашенный в синий цвет объект снят на белом фоне, то автоматическая печатающая машина добавит желтый цвет, чтобы скомпенсировать определенный ею избыток синего, и в результате объект получится блекло-серым на желтом фоне. Контролер на конце линии, незнакомый с научной

59

фотографией, пропустит отпечаток к разочарованию пострадавшего микроскописта.

Следует отметить, однако, что отличные фотомикрографические отпечатки могут быть получены и при использовании негативной пленки, если они изготавливаются индивидуально оператором, который понимает, какой требуется результат. К сожалению, они будут намного дороже, чем отпечатки или слайды, полученные стандартным способом. Если отпечатки изготавливаются не автоматически, а «вручную», полезно дать оператору слайд или отпечаток с правильной цветопередачей или хотя бы объяснить ему, каким должен быть фон, — например, белым.

Кроме причин, упомянутых выше, следует отметить, что большинство обратимых пленок более контрастны и имеют несколько большее разрешение, чем негативные пленки с такой же чувствительностью, поэтому многие издатели по-прежнему предпочитают обратимые пленки отпечаткам. Кроме того, слайды ценны сами по себе, поскольку их можно показывать через проектор, тогда как негативы имеют ценность только как промежуточный продукт на пути получения отпечатков.

8.3.2. Печать со слайдов

Для получения отпечатков со слайдов есть несколько систем фирм Agfa, Ilford, Kodak и некоторых других. Их используют в коммерческих лабораториях по обработке пленки, однако они достаточно просты для использования в обычной лабораторной темной комнате и не требуют большого количества специального оборудования. Для печати фотомикрографий хорошо подходит проявитель Cibachrome фирмы Ilford, отчасти потому, что он несколько контрастнее других проявителей. Он малочувствителен к небольшим ошибкам в экспозиции и балансе цветов, и если один раз наладить печать с правильно экспонированных слайдов, изготовленных на определенном типе пленки, то в дальнейшем можно получать с минимальными усилиями отличные результаты. Еще одно преимущество печати в лаборатории состоит в том,. что под наблюдением микроскописта можно варьировать баланс цветов до тех пор, пока не получится нужный результат. Для проявления требуются лишь три раствора, и готовый отпечаток может быть получен через 12 мин после экспозиции. Для лабораторного использования можно рекомендовать также фото бумагу Ektachrome 22 фирмы Kodak, обрабатываемую в проявителе R3000 той же фирмы.

Таблица 3.2. Цветовая температура некоторых источников света

Действительно, отпечатки, полученные со слайдов любым из описанных выше способов, будут значительно дороже, чем изготовленные автоматически с негативной пленки. Однако опыт показывает, что печатать требуется только с определенных слайдов, а не со всей пленки, за счет чего потенциальная стоимость работы снижается.

8.3.3. Цветовая температура

В так называемом белом свете существует распределение энергии между различными участками спектра видимого света — от фиолетового до красного. Но свет, который обычно называют «белым», не одинаков. Так, например, свет полуденного солнца несет большую долю своей энергии в виде коротковолнового (синего) излучения по сравнению со светом от вольфрамовой спирали обычной лампы накаливания, который содержит больше длинных волн (красного света). Это свойство света называется его цветовой температурой, поскольку оно зависит от выражаемой в градусах Кельвина температуры источника излучения (табл. 3.2).

Наша система глаз — мозг замечательно компенсирует различия в цвете окружающего освещения. Так, например, страницы, на которых напечатана данная книга, будут выглядеть для человека белыми как при дневном свете, так и при электрическом и даже при свете свечи. Цветная пленка возможностями компенсации не обладает, так что фотографии будут различаться: они будут более синими при съемке с дневным светом и более красными при съемке с лампой накаливания. Поэтому цветные пленки изготавливаются так, что их цветопередача сбалансирована для определенной цветовой температуры. Пленки для дневного цвета сбалансированы для цветовой температуры 5500 К, пленки для искусственного света (или света от лампы накаливания) — для 3100, 3200 или 3400 К.

60

Таблица 3.3. Фильтры Wratten для цветовой коррекции

Однако многие источники света не соответствуют в точности данным значениям цветовой температуры, кроме того, вы можете захотеть использовать при работе с микроскопом, снабженным лампой накаливания, более доступные пленки для дневного света. Поэтому для получения правильного цветового баланса необходимо пользоваться корректирующими цвет светофильтрами. В табл. 3.3 дана инструкция по использованию светофильтров из серии Wratten фирмы Kodak, пожалуй наиболее известных и удобных.

Поскольку цветовая температура зависит от напряжения на лампе, необходимо следить за тем, чтобы напряжение была одним и тем же для всех микрографий. Измерять его лучше непосредственно на патроне лампы, а не на источнике питания, так как вследствие сопротивления кабеля на нем возникает падение напряжения, приводящее к красному сдвигу.

При полном накале лампы свет может быть слишком ярким для того, чтобы нормально рассматривать препарат и снимать его даже с самыми короткими выдержками. В этом случае следует использовать нейтральные светофильтры, которые равномерно поглощают свет различных длин волн и снижают интенсивность освещения, не меняя цветов. Не все «серые» светофильтры являются вполне нейтральными. Предпочтение следует отдавать фильтрам с зеркалоподобным, частично пропускающим свет металлическим покрытием, которые специально выпускаются фирмами — изготовителями микроскопов.

Некоторые современные фотомикроскопы снабжены системами для поддержания необходимой цветовой температуры. Один из принципов их действия состоит в стабилизации нужного напряжения на лампе на все время или только на время фотографирования. В этом случае изменения яркости (и соответственно экспозиции) достигаются введением нейтральных светофильтров, встроенных в осветительную систему микроскопа. Другой путь состоит в использовании измерителя цветовой температуры, который можно приобрести отдельно или в качестве принадлежности к некоторым фотомикрографическим камерам. В этом случае изменяют накал лампы и/или вводят коррекционные светофильтры таким образом, чтобы по показаниям прибора получить правильную цветовую температуру.

8.3.4. Коррекция цветовых искажений

Даже в тех случаях, когда были приняты все меры к тому, чтобы привести цветовую температуру осветителя в соответствие с применяемой пленкой, цвета на получающихся слайдах могут быть не совсем правильными. Это может произойти из-за того, что слегка окрашено стекло линз в осветительной или проекционной частях микроскопа, но чаще всего — вследствие желтой окраски заливочной среды. Такие небольшие отклонения можно компенсировать, если использовать слабые компенсационные светофильтры (маркировка СС) фирмы Kodak и других изготовителей. Фильтры бывают красные, зеленые, синие, желтые, пурпурные и сине-зеленые. Слайды следует просматривать на световом столике с откорректированным цветом, и компенсационные светофильтры следует вставлять по одному или в комбинации до тех пор, пока не будет получен правильный цвет. Установка этих светофильтров на пути лучей в микроскопе позволяет нейтрализовать цветовое искажение, хотя надо помнить, что пленка не обязательно так же чувствительна к изменению цвета, как и глаз.

УФ-свет цветные пленки воспринимают как синий. Лампы некоторых микроскопов дают значительную долю УФ-света, что может вызывать синий сдвиг на микрографии. Фильтры Wratten 2А, 2В и 2Е поглощают УФ-свет, и с помощью одного из этих бледно-желтых фильтров можно избежать возникающего затруднения.

Некоторые изготовители рекомендуют использовать светофильтр из дидимового стекла, особенно при фотографировании препаратов, окрашенных эозином. Этот светофильтр обладает свойством усиливать розовые тона и может в определенных случаях значительно улучшать передачу цвета.

8.3.5. Реципрокное несоответствие и цветовой баланс

При слишком коротких и слишком длинных экспозициях на цветной пленке проявляется реципрокное несоответствие, поэтому требуется корректировка выдержек подобно тому, как это делается в случае чернобелой пленки (разд. 7.2). Но цветная пленка имеет и дополнительный минус: три слоя ее эмульсии, чувствительные к трем основным цветам, теряют светочувствительность с различной скоростью, что приводит к неправильной цветопередаче. Как правило, для фотомикрографии при низких уровнях освещенности

61

рекомендуются пленки для искусственного света, которые дают правильный баланс цветов при экспозициях более длинных, чем те, на которые рассчитаны пленки для дневного света.

Исправление цветового баланса можно сделать и при фотопечати, однако в случае слайдов корректирующие светофильтры следует использовать непосредственно при съемке. Каждый тип пленки имеет свое реципрокное несоответствие, так что перед применением светофильтров следует проконсультироваться с изготовителем пленки. Поскольку иногда не удается полностью исправить дисбаланс цветов, обусловленный реципрокным несоответствием, лучше избегать экспозиций больших, чем 5 с, используя более чувствительную пленку или более яркий источник света.

Отсняв несколько пробных пленок и тщательно записав все необходимые условия, можно всегда получить микрографии с правильной цветопередачей, если использовать стандартную яркость лампы и комбинацию светофильтров, компенсирующих особенности данного сочетания микроскопа, пленки и метода (разд. 11.4).

8.3.6. Выбор чувствительности пленки

В продаже имеются цветные пленки с чувствительностью от 25 до 1600 или 3200 ед. ISO. Наилучшее качество изображения и контрастность достигаются при использовании малочувствительных пленок (до 100 ед. ISO). Поэтому их рекомендуют использовать для обычной фотомикрографии, где освещение, как правило, достаточное. Когда необходима большая чувствительность, например при съемке на темном фоне, при фазовоконтрастной или флуоресцентной микроскопии, то без большой потери качества можно использовать пленки с чувствительностью 200—400 ед. ISO. В таких случаях можно применить метод «усиления» пленки, позволяющий увеличить ее чувствительность за счет изменения режима проявления (путем увеличения времени пребывания пленки в первом проявителе). Таким способом чувствительность пленки может быть увеличена в 2 или в 4 раза. Данный метод полезен в случае использования пленок 200 и 400 ед. ISO, причем проявление с усилением может быть осуществлено в некоторых лабораториях за стандартную цену. Помимо увеличения эффективной чувствительности пленки этот метод позволяет в ряде случаев еще и повысить контраст. Недостатки метода, обычно не имеющие большого значения, состоят в том, что увеличивается зернистость пленки и уменьшается ее максимальная плотность, что приводит к появлению бледно-серого фона при темнопольной или флуоресцентной микроскопии.

8.3.7. Фотомикрография при флуоресцентной микроскопии

Фиксирование изображений при флуоресцентной микроскопии сопряжено с особыми трудностями, которые вызваны тем, что флуоресцирующие детали могут занимать малую часть кадра, быть сравнительно нечеткими и выцветать под действием возбуждающего света при длительной экспозиции. Все эти факторы "приводят к неправильной установке экспозиции, и, кроме того, длительная выдержка ведет к реципрокному несоответствию. Тем не менее, используя лучшие методы микроскопии, при съемке флуоресцентных препаратов можно достичь вполне хороших результатов.

За исключением случаев особо малых увеличений работать следует с эпиосвещением, когда свет падает на препарат через объектив. Эпифлуоресценция имеет те преимущества, что непоглощенный свет идет в направлении от наблюдателя; освещается непосредственно та поверхность, которую нужно наблюдать; наконец, упрощается центровка света, так как объектив служит сам для себя конденсором. Количество света, проходящее через линзу, пропорционально квадрату ее апертуры. В случае эпиосвещения, поскольку объектив работает одновременно и как конденсор, яркость препарата пропорциональна четвертой степени апертуры. Поэтому фирмы-изготовители специально создают для флуоресцентной микроскопии объективы с большой апертурой (что часто достигается применением масляной, глицериновой или водной иммерсии) в сочетании с малым увеличением. Их применение дает преимущества именно для фотомикрографии.

В тех приборах, где предусмотрено измерение экспозиции & пятне, им следует пользоваться таким образом, чтобы измеряемая область находилась во флуоресцирующей части препарата. Если системы измерения в пятне нет, то время экспозиции следует уменьшить по сравнению с показаниями экспонометра на величину, пропорциональную нефлуоресцирующей части поля зрения. Это с неизбежностью приведет к искажению экспозиции, так что во всех случаях следует делать несколько кадров, используя широкий диапазон выдержек.

Поскольку уровень освещенности при флуоресценции крайне низок, то следует применять пленки с чувствительностью 200—400 ед. ISO или даже выше. Дальнейшего увеличения чувствительности можно с успехом достичь с помощью метода «усиления» (разд. 8.3.6). Многие фотосистемы микроскопов содержат светоделительную призму, которая разделяет поток света от объектива так, что часть его попадает в окуляры, а часть — в фотокамеру. При флуоресцентной микроскопии, там где это возможно, желательно удалить светоделительную призму, чтобы при визуальном наблюдении весь свет шел в окуляры, а при фотографировании — в камеру. Этим можно удвоить количество света, попадающего на пленку, а экспозиция может сократиться даже больше, чем вдвое, если учесть выцветание препарата и реципрокное несоответствие. В некоторых фотомикрографических камерах при длительной экспозиции, необходимой в случае флуоресценции, на пленку может попадать достаточно постороннего света, чтобы вызвать появление вуали. Этот свет, попадающий через окуляры, накладывает на изображение препарата изображение окна или ламп в комнате или служит причиной неправильного определения экспозиции. Некоторые микроскопы снабжены шторкой, препятствующей попаданию такого света, но если шторки нет, то эта проблема добавляется к

62