1.Изготовьте на криостате срезы с нефиксированной почки и зафиксируйте их в течение 1, часа кальций-формолом*.

2.Смонтируйте срезы на предметные стекла и дайте им подсохнуть.

3.Удалите липиды для получения отрицательного контроля (см. Контроль)

4.Промойте опытные и контрольные срезы в 70%-ном (объем на объем) водном этаноле.

5.Окрасьте опытные и контрольные срезы в течение 15 мин в насыщенном растворе Судана черного в 70%-ном (объем на объем) водном этаноле. Перед окраской раствор красителя надо профильтровать.

6.Отдифференцируйте срезы в 70%-ном (объем на объем) водном этаноле до тех пор, пока лишенный липидов контроль не станет бесцветным.

7.Промойте водой и заключите в глицероловое желе**.

Результаты. Триглицеролы и ненасыщенные эфиры холестерола окрашиваются в сине-черный цвет; некоторые фосфолипиды выглядят коричневыми.

Контроль. Экстрагируйте срезы смесью хлороформ—метанол 2 : 1 (объем на объем) в течение 2 часов при комнатной температуре. Это позволит удалить все свободные липиды, после чего окраска не возникнет. Из некоторых липопротеинов липиды можно удалить добавлением к метанолхлороформной смеси 1.% (объем на объем) концентрированной соляной кислоты.

Возможные трудности: если в синий цвет окрашиваются ядерные или богатые гликозаминогликанами участки, то замените судан черный.

*Для приготовления кальций-формола разведите 10 мл коммерческого 40%-ного (вес на объем) водного раствора формальдегида водой (100 мл). К полученному раствору добавьте 1 г СаС12.

**Заливочная среда экстрагирует неионные красители.

липидов с применением брома и Судана черного — в табл. 5.15, а метод выявления фосфолипидов с применением брома, ацетона и Судана черного — в табл. 5.16.

3.2. Выявление биологических объектов

3.2.1. Биологические объекты

Разнообразие выявляемых с помощью гистохимии биологических объектов как с точки зрения химического состава, так и с точки зрения размеров ничем не ограничивается. Можно выявлять объекты на молекулярном уровне, например антигены и рецепторы, или более крупные объекты, такие, как разнообразные субклеточные структуры и органеллы. И разумеется, окрашивание используется для выявления определенных типов клеток и организмов, для чего в настоящее время часто используется иммунное окрашивание. Традиционным подходом является определение биологических объектов, о чем свидетельствуют такие термины, как «эозинофил» или «грамположительная бактерия».

Механизмы гистохимических методов также слишком разнообразны, чтобы ко всем можно было дать пояснения, отметим только, что в этих методах могут применяться маркеры всех типов, упомянутых и обсуждавшихся выше, или, как в приведенном ниже примере, избирательность может основываться на физических различиях.

Таблица 5.15. Выявление суммарных липидов бромом—Суданом черным

Возьмите смонтированные срезы и, начиная с этапа 2 табл. 5.14, продолжайте следующим образом.

1.Погрузите срезы в 2,5%-ный (объем на объем) водный раствор брома на 30 мин при комнатной температуре. ОБЯЗАТЕЛЬНО пользоваться вытяжным шкафом.

2.Промойте их в воде, а затем в 0,5%-ном (вес на объем) водном растворе метабисульфита натрия в течение 1 мин.

3.Хорошо промойте в воде. Продолжите процедуру с этапа 3 табл. 5.14.

Таблица 5.16. Выявление фосфолипидов методом бром—ацетон—судан черный

Возьмите обработанные бромом срезы, полученные на этапе 3 табл. 5.15, и продолжите следующим образом.

1.Хорошо высушите срезы*.

2.Проэкстрагируйте безводным ацетоном 20 мин при 4°С*.

3.Удалите растворитель и дайте ацетону испариться. Продолжите процедуру с этапа 3 табл. 5.14. Результаты. Фосфолипиды окрасятся в сине-черный цвет.

Контроль. Удалите суммарные липиды («Контроль» в табл. 5.Г4), после чего окрашивания не должно быть.

* Не должно оставаться даже следов воды, так как в противном случае наряду с нейтральными

107

липидами проэкстрагируются фосфолипиды.

I. Выявление исчерченности в мышцах. Традиционный метод выявления А- и I-дисков в мышцах основывается на образовании in situ координационного комплекса (или комплексов?) железа с гематеином. Избирательность обеспечивается в основном за счет контролируемого вымывания краски (дифференцирования).

Процедура окраски железным гематоксилином по Гейденгайну описана в табл. 5.17.

Таблица 5.17. Выявление поперечной исчерченности в мышцах

1.Изготовьте продольно ориентированные срезы толщиной 6 мкм со скелетных мышц, залитых в парафин. Ткань может быть зафиксирована любым способом.

2.Распарафннируйте срезы ксилолом и проведите через серию спиртов, в воду.

3.Обработайте (протравите) срезы 5%-ным (вес на объем) водным раствором сульфата железа и аммония (железоаммонийных квасцов) в течение 1 часа.*

4.Промойте срезы дистиллированной водой.

5.Окрасьте их гематоксилином в течение 1 часа. **

6.Промойте проточной водой.

7.Аккуратно отдифференцируйте срезы, чередуя промывку в дифференцировочном растворе*** с промывкой в проточной воде. После каждого цикла их следует просматривать в микроскоп. Процедуру проводить до тех пор, пока не станет видна исчерченность мышц.

8.Промойте проточной водой в течение 10 мин.

9.Проведите обезвоживание в серии спиртов возрастающих концентраций, затем в ксилоле, и заключите препарат в синтетическую смолу.

Результаты. После окрашивания гематоксилином все структуры становятся черными или серыми. После проведенной на этапе 7 дифференцировки окраска остается в менее проницаемых структурах (перечислены в порядке возрастания устойчивости к дифференцировке): митохондриях, поперечнополосатых мышцах, хроматине ядра и хромосомах, миелине, эритроцитах, кератине.

Возможные трудности: если после этапа 5 окрашивание слишком бледное, то увеличьте время инкубации в растворах квасцов и гематоксилина. Если вам трудно проконтролировать степень дифференцировки, то попробуйте воспользоваться другим дифференцирующим раствором, описанным в примечаниях. Если окраска выцветает со временем, то увеличьте время промывания в воде после окраски.

* Оптимальное время обработки квасцами и железным гематоксилином зависит от применявшейся фракции. После использования растворов формальдегида (а также паров формалина, фиксаторов Сузи, Буэна и Карнуа) обычно достаточно инкубации в каждом растворе в течение 1 часа. После фиксаторов с бихроматом (например, Ценкера и Гелли) требуется обработка в течение 3 часов, а после фиксаторов, содержащих че-тырехокись осмия, еще дольше, например после фиксатора Флемминга — до 24 часов.

**Для приготовления раствора красителя растворите 0,5 г гематоксилина в 10 мл этанола, добавьте 90 мл дистиллированной воды и оставьте раствор окисляться на воздухе в течение 4 недель.

***Для дифференцировки в стандартных условиях применяется 5%-ный (вес на объем) водный раствор сульфата железа и аммония. Другие способы — развести данный раствор равным объемом дистиллированной воды либо воспользоваться насыщенным спиртовым раствором пикриновой кислоты. Оба последних раствора позволяют лучше контролировать процесс дифференцировки.

3.2.2. Биологические процессы

Взаимодействие гистохимических красителей с живыми клетками или организмами позволяет непосредственно наблюдать многие процессы. Определение биологической или химической природы объектов, рассмотренное выше, также используется для выяснения биологических процессов, хотя и менее прямым путем.

С помощью гистохимии можно выявлять процессы, разнообразные как по масштабам, так и по физиологической роли. Можно, например, наблюдать движения ресничек или жгутиков простейших, если добавить в окружающую их водную пленку окрашенные коллоиды; с помощью рН-зависимых флуорохромов можно следить за изменениями рН в лизосомах во время фагоцитарной активности культивируемых макрофагов; можно непосредственно наблюдать электрическую активность нейронов зрительной коры после включения в них потенциал-зависимых флуорохромов.

Гистохимия и световая микроскопия

Таблица 5.18. Выявление живых клеток с помощью флуоресцеиндиацетата

108