друга. Детали их изображений могут совпадать, давая видимость суперструктуры. Сравнение изображений, полученных с помощью электронной и световой микроскопии, в ряде случаев не подтверждает наличия хорошо известного по светооптическим изображениям рисунка панциря.

10. Благодарности

Я хотел бы поблагодарить профессора Кертиса (Kurtis) за его вклад в раздел, посвященный интерференционной отражательной микроскопии. Если бы не курсы, проводимые в летних школах Королевского микроскопического общества, мои практические знания в микроскопии были бы значительно беднее, а если бы не терпеливые и вдумчивые студенты, слушавшие эти курсы на протяжении ряда лет, я не решился бы написать две первые главы. Я выражаю большую благодарность издателям за их помощь в художественном оформлении и постоянное участие.

11. Литература

1.Humason, G. L. (1962) Animal Tissue Techniques. W. H. Freeman and Co., San Francisco.

2.Ross, K. F. A. (1967) Phase Contrast and Interference Microscopy for Cell Biologists. E. Arnold, London.

3.Barer, R. and Joseph, S. (1954) Quart. J. Microsc. Sci., 95, 399.

4.Barer, R. and Joseph, S. (1955) Quart. J. Microsc. Sci., 96, 1.

5.Barer, R. and Joseph, S. (1955) Quart. J. Microsc. Sci., 96, 423.

6.Frey-Wissling, A. (1957) Macromolecules in Cell Structure. Harvard University Press, Cambridge, MA.

7.Ruthman, A. (1970) Methods in Cell Research. C. Bell and Sons, London.

8.Schmidt, W, 7. and Keil, A. (1958) Die gesunden und die erkranten Zahn-gewebe des Menschen und der Wirbeltiere im polarisation Mikroskop. Carl Hanser Verlag, Munchen.

9.Roelofsen, P. A. (1959) The Plant Cell Wall. Gebruder Borntraeger, Berlin — Nikolessee.

10.Spencer, M. (1982) Fundamentals of Light Microscopy. Cambridge University Press, Cambridge, UK.

11.Curtis, A. S. G. (1964) J. Cell Sci., 20, 199.

12.Gingell, D. and Т odd, I. (1970) Biophsy. J., 26, 507.

13.Gingell, D. and Todd, I. (1980) J. Cell Sci., 41, 139.

14.Gingell, D. (1981) J. Cell Sci., 49, 237.

15.Opas, M. (1988) J. Cell Sci., 90, 215.

16.Verschueren, H. (1985) J. Cell Sci., 75, 279.

17 Heath, J. P. and Dunn, G. A. (1978) J. Cell Sci., 29, 197. 18. Bailey, and Gingell, D. (1988) J. Cell Sci., 90, 215. 19 Ploem, J. S. (1975) In Mononuclear Phagocytes in Immunity, Infection and Pathology. Furth, R. V. (ed.)

Blackwells Scientific Publications, Oxford, UK.

20.McCrone, W. J. and Delly, J. G. (1973) Particle Atlas. Ann Arbor Scientific Publishers, Ann Arbor, MI, vol. 2.

21.Taylor, R. B. (1980) Proc. R. Microsc. Soc., 15, 27.

22.Kuflinski, F. B. and Pappelis, A. J. (1971) Phytopath., 61, 724.

23.Nielson, Т. В., Field, J. B. and Dedman, /. R. (1987) J. Cell Sci., 87, 327.

ФИКСИРОВАНИЕ ИЗОБРАЖЕНИЯ

Питер Дж. Эвеннет

1. Введение

Никакое зафиксированное изображение не может сравниться по красоте и производимому впечатлению с оригинальным, которое можно непосредственно наблюдать в микроскопе, слегка вращая микровинт. Тем не менее запись изображений необходима прежде всего потому, что она постоянна в отличие от недолговечного препарата. Кроме того, ее можно изучать вне лаборатории, сравнивать с другими изображениями, измерять или анализировать различными способами, демонстрировать на лекции, публиковать в статье или в учебнике.

43

В настоящей главе кратко рассмотрены способы фиксирования изображения с помощью рисования, однако основное-содержание главы составляет описание оборудования и техники для фотомикрографии. Для успешной фотомикрографии необходимо учитывать множество условий, касающихся микроскопа, его осветительной системы, пленки, ее обработки и т. д. Автор считает, что правильный подход к столь сложной методике состоит в том, чтобы понять эти факторы и основы тех или иных процедур, а не в том, чтобы эмпирически подбирать условия. Наша цель — дать здесь достаточную теоретическую подготовку для того, чтобы читатель мог разбираться в процедурах и устранять неполадки.

Читатель, уже имеющий опыт в фотомикрографии, может начать непосредственно с практических рекомендаций, приведенных в разд. 11, обращаясь к основному тексту по мере необходимости. Те, кто сначала прочтут основной текст, увидят, что практический разд. 11 суммирует приведенные данные и помогает правильно понимать технические моменты.

2. Рисование

Рисование является старейшим методом фиксирования изображения, практикуемым со времени появления микроскопии. Оно имеет преимущества, благодаря которым сохраняет свою ценность и по сей день. Его не следует рассматривать как просто самый дешевый и не требующий технического оснащения способ, заменяющий более сложные методы; это метод, не требующий при современных вспомогательных средствах больших художественных способностей. С помощью рисунка можно передать представление об идеальном гипотетическом препарате, игнорируя дефекты и комбинируя детали, обнаруженные в разных полях зрения, на разной глубине фокуса, а также при большом и малом увеличениях. Препарат, который мало пригоден для фотомикрографии, тем не менее можно зафиксировать в форме высококачественного рисунка. Кроме того, при рисовании с микроскопа не нужно применять дорогие объективы с плоским полем зрения.

Окуляры, в фокальной плоскости которых имеется расчерченная на квадраты пластинка (как, например, изображенные на рис. 7.7, A), которая как бы накладывается на изображение, являются простейшим вспомогательным средством при рисовании рукой. Если кроме этой сетки использовать сетку подходящих размеров, подкладываемую под бумагу или слегка наносимую на нее, то можно соблюсти пропорции при передаче принципиально важных деталей. Тонкие детали можно затем внести на глаз.

С помощью специальной призмы или просто зеркала, которое устанавливается по углом 45° прямо на окуляре, можно спроецировать изображение непосредственно на лист бумаги и обвести контуры препарата с соблюдением точных пропорций. Следует только обратить внимание на то, чтобы изображение проецировалось на бумагу строго перпендикулярно, иначе в геометрии рисунка возникнут искажения. Для проецирования микроскоп должен быть снабжен мощным источником света и стоять в затемненной комнате.

Камера-люцида (camera lucida), или ее современный вариант— рисовальный тубус, дает наибольшие удобства. Камера-люцида состоит из светоделительной призмы, смонтированной поверх окуляра, и зеркала, закрепленного таким образом, чтобы кончик карандаша при рисовании на бумаге оказался видимым поверх изображения в микроскопе. Рисовальный тубус работает сходным образом, но он устанавливается внутри микроскопа, обычно под бинокулярной насадкой, что позволяет видеть карандаш и бумагу непосредственно в окуляры. Он может также иметь дополнительные приспособления для фокусировки и для установки различных размеров рисунка. При использовании каждого из этих методов важно установить правильное соотношение между яркостью изображения в микроскопе и освещением бумаги для рисования, возможно подстраивая их по ходу работы так, чтобы было удобно одновременно наблюдать и то и другое.

3. Фотомикрография

Фотомикрография — это фиксирование изображения, получаемого в микроскопе с помощью фотографии. Не следует путать (по крайней мере в английском языке) фотомикрографию и микрофотографию. Последний термин относится к изготовлению очень маленьких фотографий.

Фотография применяется вместе с микроскопом со времени ее возникновения, и в последние 50 лет она являлась основным способом фиксирования изображения. Преимуществами фото-микрографии являются: точность, беспристрастность, воспроизводимость, простота и возможность получения высококачественных результатов. Но все эти преимущества могут быть реализованы лишь при наличии хорошего оборудования и его аккуратном использовании. Фотомикрография успешно воспроизведет все дефекты препарата, оборудования или методики, поэтому при ее использовании к препарату предъявляется больше требований, чем при визуальной микроскопии.

В настоящей главе рассмотрены те аспекты использования микроскопа и методов фотографии, которые важны для получения хороших фотомикрографий.

44

4. Микроскопическое изображение с точки зрения фотографии

4.1. Разрешение

Микроскоп предназначен для получения информации о тонких деталях образца (разрешение) в виде изображения, увеличенного настолько, чтобы разрешенные детали были видны глазом. При необходимости с помощью микроскопа можно также увеличивать контрастность деталей изображения. Объектив создает первичное увеличенное изображение, которое затем еще более увеличивается, во-первых, при фотографировании на пленку, а затем при печати с пленки или при проекции слайда.

Как показано в гл. 1, разрешающая способность микроскопа ограничивается фундаментальными физическими законами. Так, минимальное разрешаемое расстояние (d) зависит от длины волны (А,) используемого света и числовой апертуры объектива (NA):

d =0.61λ/NA

На практике величину А, можно считать равной 0,5 мкм (зеленый свет), a d легко можно вычислить, зная апертуру объектива; чем больше NA, тем более тонкие детали можно различить.

4.2. Разрешающая способность и размер отпечатка

Разрешающая способность глаза составляет около одной десятой миллиметра (100 мкм) при стандартном минимальном расстоянии ясного зрения 250 мкм. Если конечное изображение, полученное в микроскопе и представленное в виде отпечатка, увеличено настолько, что минимальное разрешаемое расстояние в нем будет 100 мкм, то для наблюдателя отпечаток будет выглядеть «резким» — человек с хорошим зрением увидит на нем все детали. Если очень важно сделать различимыми самые мелкие детали, то увеличение следует дать несколько большее, чтобы разрешение было 200—300 мкм и детали были легко различимы при недостаточном освещении, а также людям с ослабленным зрением. Любое дальнейшее увеличение называется «пустым увеличением», так как оно приводит лишь к нечеткости изображения.

С помощью формулы из разд. 4.1 можно показать, что для микрографий, рассматриваемых с нормального расстояния для чтения, достаточное общее увеличение (включая увеличение при печати) составляет 500— 1000XNA используемого объектива; на это число следует в основном ориентироваться на практике. Иллюстрацией к сказанному служит рис. 3.1. В качестве примера взят объектив с апертурой '1,0, дающий при использовании зеленого света (А,=0,5 (мкм) разрешение 0,3 мкм. При общем увеличении 500:1 (500XNA) размер деталей изображения будет 150 мкм, при увеличении 1000:1—300 мкм. Когда речь идет о проекции слайда, то необходимо учитывать размер изображения на экране и расстояние, с которого на него смотрят. Как правило, при этом достаточно иметь увеличение на пленке около 200 XNA.

4.3. Получение на пленке действительного изображения

В принципе микроскоп создан в расчете на глаз. Лучи, выходящие из окуляра, являются 'параллельными, и, попадая в нормальный аккомодированный на бесконечность глаз, они сходятся, давая изображение на сетчатке. В результате мы видим так называемое мнимое изображение, которое соответствует увеличенному предмету, отнесенному в бесконечность. Окуляры в этих условиях работают вместе с хрусталиком, давая действительное изображение на сетчатке (действительным называют изображение, которое может быть получено на экране или пленке). Следовательно, при использовании микроскопа для фотомикрографии его следует модифицировать одним из указанных ниже способов для получения действительного изображения на пленке, расположенной на конечном расстоянии от окуляра.

45

Рис. 3.1. Увеличение и разрешение. Три микрографии, полученные с использованием объективов с различной апертурой и увеличением и отпечатанные с конечным увеличением 400:1. А. Объектив 4/0,16. Конечное увеличение 2500XNA. Изображение нерезкое и имеет большой излишек увеличения. Б. Объектив 10/0,25. Конечное увеличение 1600XNA. Изображение по-прежнему не несет информации о мелких деталях. В. Объектив 25/0,65. Конечное увеличение 615XNA. Изображение содержит хорошо воспроизведенные мелкие детали. Шкала 50 мкм.

Рис. 3.2. Методы формирования действительного изображения. А. Формирование изображения глазом. Микроскоп настроен так, что первичное изображение попадает прямо в передний фокус глазной линзы окуляра, и, следовательно, в глаз попадает параллельный пучок света, который фокусируется на сетчатке. Б. За счет увеличения расстояния между препаратом и объективом первичное изображение располагается ниже. Это приводит к тому что из окуляра выходит сходящийся пучок света, который формирует действительное изображение в плоскости, куда можно установить пленку, однако в этих условиях качество создаваемого объективом изображения ухудшается. В. Препарат и первичное изображение находятся в правильном положении, но окуляр отодвинут дальше для увеличения расстояния между первичным изображением и глазной линзой, что приводит к формированию действительного изображения на пленке. Г. Микроскоп настроен обычным образом, а для формирования действительного изображения на пленке применяется специальная проективная линза — «фотоокуляр». Д. Нормальный окуляр используется в сочетании с собирающей линзой в специальной установке для фотомикрографии, оптическая система напоминает глаз, как в A.

При визуальном наблюдении первичное изображение располагается в фокальной плоскости окуляра, давая на выходе из него параллельный пучок лучей (рис. 3.2, а). Если, фокусируя микроскоп, удалить от окуляра первичное изображение, то выходящие из окуляра лучи будут сходиться и давать действительное изображение в плоскости, в которую следует поместить пленку (рис. 2.3,5). Такой метод получения действительного изображения не требует дополнительного оборудования, однако он дает не лучшие результаты, так как расстояния между сопряженными плоскостями (препарата и объектива; объектива и первичного изображения), для которых рассчитывается исправление сферической аберрации при изготовлении объектива, становятся «ороче или длиннее. Поэтому указанный метод может давать удовлетворительные результаты при использовании пленки большого формата (поскольку благодаря относительно большому расстоянию от окуляра до пленки здесь требуется незначительная перефокусировка микроскопа) или объективов с малой числовой апертурой (которые менее чувствительны к дефокусировке), однако он неприемлем для качественной работы. Когда другие способы неприменимы, изображение можно получить, выдвигая окуляр из тубуса и затем фиксируя его. При этом микроскоп остается сфокусированным так же, как при визуальном наблюдении (рис. 3.2,5).

46