меньше того количества энергии, которое требуется для возбуждения.

Для наблюдения флуоресценции абсолютно необходимо предотвратить смешение в микроскопическом изображении возбуждающего света и испускаемой флуоресценции. Качество изображения во флуоресцентной микроскопии в значительной степени определяется контрастом и яркостью изображения. Контраст изображения определяется отношением флуоресценции специфически окрашенных структур к фоновому свету. Однако оптимальный контраст может достигаться в слабых флуоресцентных изображениях благодаря, например, использованию узкополосных светофильтров, которые часто имеют небольшое пропускание. В то же время для облегчения визуальных наблюдений, для фотографирования с использованием относительно коротких выдержек и для измерений требуется сравнительно яркое изображение. Таким образом, в большинстве случаев необходимо достичь компромисса между интенсивностью специфической флуоресценции и уровнем неспецифической флуоресценции фона.

Читатель, желающий познакомиться с обзорами по флуоресцентной микроскопии, может найти их в работах Янга [1], Прайса [2], Роста [3], Сэйджела [4], Плоэма и Тэнка [5]. Современные способы применения метода в биомедицинских исследованиях описаны в книге Лансинга Тэйлора с соавт. [6J.

Рис. 6.1. Спектры возбуждения и испускания флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ). А, — длина волны возбуждающего (сплошная линия) и испускаемого (штриховая линия) света. Воспроизводится с разрешения Oxford University Press.

2. Флуорохромы

Вещества, флуоресцирующие при освещении, называются флуорофорами или флуорохромами. Различные флуорохромы характеризуются специфическими спектрами поглощения и испускания. Спектры поглощения или испускания определяют путем измерения относительной интенсивности флуоресценции при определенной длине волны, когда препарат возбуждается светом различных длин волн. Наиболее интенсивная флуоресценция наблюдается тогда, когда препарат облучается светом с длиной волны, близкой к максимуму на кривой возбуждения. Кривая испускания определяется при возбуждении светом определенной длины волны. Примеры спектров поглощения и испускания приведены на рис. 6.1. В большинстве случаев кривые поглощения и испускания частично перекрываются. Другой характеристикой флуорохромов является их квантовая эффективность (Q), которая определяется как соотношение между поглощенной и выделенной энергиями. Флуорохромы с низкой Q, которые испускают мало света по сравнению со своим уровнем поглощения, относятся к слабым флуорохромам.

Снижение интенсивности флуоресценции во время освещения называется выцветанием. Степень выцветания зависит от интенсивности возбуждающего света и времени экспозиции [7]. Уменьшение флуоресценции может быть также следствием модификации возбужденного состояния флуорофора. Эти физико-химические изменения могут быть вызваны наличием других флуорофоров, окислителей или солей тяжелых металлов. Данный процесс называется тушением и является весьма сложным. Для того чтобы замедлить снижение уровня флуоресценции, приготовленные флуоресцирующие препараты лучше всего хранить при Н-4°С в темноте. Другим способом сохранения флуоресценции является добавление в заливочную среду таких веществ, как DABCO (1,4-диазобицикло-2,2,2-октан), N-пропил-галлата и яара-фенилендиамина [8, 9].

Например, добавление 5% (объем на вес) раствора пропил-галлата в глицероле к меченным родамином препаратам продлевает продолжительность флуоресценции с 60—90 сек до 15—25 мин. Это особенно ценно в тех случаях, когда необходимо получить с препаратов фотомикрографии. В случае применения стабилизирующих флуоресценцию веществ желательно исследовать или фотографировать препарат сразу после заключения, так как при хранении из-за эффекта тушения интенсивность флуоресценции может уменьшиться

[8, 9].

3. Флуоресцентный микроскоп

Флуоресцентный микроскоп должен отвечать двум основным требованиям. Во-первых, возбуждение флуорофора в препарате должно быть эффективным и желательно, чтобы оно происходило при длинах волн, близких к максимуму его поглощения [10]. Во-вторых, микроскоп должен собирать как можно больше света флуоресценции.

Три компонента необходимы для наблюдения флуоресценции: флуорофор, источник света и блок регистрации флуоресценции. Помимо этих необходимых элементов, требуются фильтры для выделения

117