микроскопии, поскольку фиксация, например если она вызывает коагуляцию и преципитацию, может привести к появлению границ раздела, сильно рассеивающих свет. Хорошо известная из обыденного опыта ситуация: белок вареного яйца выглядит белым благодаря своему светорассеянию, в то время как до тепловой коагуляции он прозрачен и невидим. Подробности, касающиеся фиксации, приведены в ряде гистохимических прописей в разд. 2.2.2 гл. 5.

Очень полезным может оказаться сравнение линейных размеров или площади структур в живых клетках и после фиксации и изготовления постоянного препарата. Если свежевыделенные клетки буккального эпителия сначала измерить с помощью фазово-контрастного микроскопа, а на другом препарате измерить их после фиксации сулемой, окраски гематоксилин-эозином, обезвоживания и заключения в канадский бальзам, то в последнем случае они могут оказаться на 20% меньше. Для статистической достоверности результатов необходимо провести многочисленные измерения клеток до и после обработки.

8. Другие методы

Практически невозможно перечислить все методы, используемые в биологии и материаловедении, которые могут быть применены для получения контраста в живых препаратах. Все время появляются новые разработки, одна из наиболее интересных среди них — сканирующая световая микроскопия, которая дает особенно заметные преимущества для исследования толстых биологических препаратов. В настоящей книге приводится краткое описание двух таких методов — дисперсионного окрашивания, важного для идентификации асбестовых волокон и применимого к живым клеткам, и второго метода, уже описанного в разд. 2.6.1 гл. 1 в связи с обсуждением глубины поля зрения.

8.1. Дисперсионное окрашивание

Как уже обсуждалось в гл. 1, изменение показателя преломления в зависимости от длины волны и степень этого изменения есть свойство вещества, через которое проходит свет. Был разработан метод дисперсионного окрашивания, использование которого для выявления асбестовых волокон, описанное МакКроуном [20], хорошо известно. Для этой цели необходим специальный объектив и возможность центрирования апертурной диафрагмы относительно линзы конденсора. Для получения дисперсионных цветов используются либо иммерсионные масла с высокой дисперсией и обычный белый свет, либо плоскополяризованный свет. Набор всего необходимого для данной методики и тестовые образцы асбеста производит фирма Triton Instruments.

Метод получения дисперсионной окраски может быть применен и для изучения таких препаратов, как клетки буккального эпителия [21]. Клетки освещаются через маленькое отверстие, расположенное ниже обычного нескорректированного конденсора. Конденсор, в котором происходит дисперсия, должен быть установлен намного ниже обычного положения, используемого при правильной фокусировке. Чтобы приспособить конденсор для получения освещения такого типа, требуется известная ловкость.

8.2. Конфокальная, сканирующая лазерная и видеосистемы

Поскольку удаление нежелательного света, идущего не из фокальной плоскости, позволяет улучшить условия наблюдения, то данные методы следует описать в главе, посвященной технике повышения контраста. Первые два метода из них были упомянуты в разд. 3 гл. 1, посвященном глубине поля зрения.

Таблица 2.17. Эпидермис лука при различных способах контрастирования

1.Возьмите кусочек внутреннего эпидермиса внутреннего листка луковицы и поместите его в воду. Наружная поверхность эпидермиса должна быть обращена к покровному стеклу с тем, чтобы можно было следить за его ориентацией по отношению к свету и к вашим глазам. Может оказаться полезным сделать два или три подобных препарата, чтобы исследовать их параллельно.

2.Приготовьте таблицу, как указано в табл. 18, оставив достаточно места для заметок по каждой методике.

3.Внесите в таблицу данные о яркости, темноте или относительной интенсивности соседних структур и структур по сравнению с фоном. Не забывайте указывать в таблице равную яркость или темноту изображения в случаях, когда в микроскопе ничего не видно или отсутствует контраст.

4.Вы, может быть, захотите оспорить некоторые комментарии, содержащиеся в табл. 18, но прежде чем это сделать, попробуйте проанализировать возможные причины расхождения ваших наблюдений с таблицей.

Эта техника обещает быть очень полезной для ряда биологических направлений, хотя необходимая аппаратура еще только разрабатывается. Конфокальная микроскопия особенно полезна во флуоресцентной микроскопии, где с ее помощью можно удалить фоновый свет, который часто снижает разрешение и ухудшает изображение оптических срезов. В биологии часто исследуют толстые прозрачные объекты, и по этой причине наблюдение срезов имеет большое значение. Процедура подготовки материала и изготовления обычных срезов

39

(на микротоме) часто приводит, как уже упоминалось выше, к усадке, которая сильно зависит от химии тканей. Использование видеомикроскопии для усиления яркости и контраста описано в гл. 8.

9. Использование разных методов контрастирования для получения информации об одном образце

Для приобретения опыта полезно просмотреть один и тот же препарат с использованием всех возможных способов микроскопии. Информация, даваемая такими изображениями, позволяет не только ответить на вопрос, как выглядит препарат, но также получить сведения о его физико-химических свойствах. Так, например, какой-либо метод может не обеспечивать правильного видимого изображения, но быть тем не менее удобным для получения сведений о показателе преломления, о поглощении, об отсутствии двулучепреломления и других взаимодействиях свет — вещество.

Клетки кожицы лука являются подходящим объектом для такого сравнения, поскольку они легкодоступны и представляют достаточный интерес (табл. 2.17), В разд. 5 по микроскопии в поляризованном свете объясняется, почему помещенный на предметный столик препарат приобретает специфическую ориентацию по отношению к наблюдателю и проходящим лучам света. Рис. 2.6 дает представление о том, как выглядят отдельные клетки в трехмерном изображении. Фотомикрографии клеток, сделанные с использованием четырех других способов контрастирования, приведены на рис. 2.7.

В табл. 2.18 сведены описания различных изображений одного и того же препарата. Эти изображения есть результаты различных взаимодействий света с веществом, и они дают качественную и количественную информацию о физико-химических свойствах препарата.

Такие данные, как показатель преломления, могут быть получены путем измерения р. о. п., например с помощью фазового контраста, а по ним можно судить о таких параметрах, как концентрация белка или масса ядра. Границы изменения показателя преломления при темнопольной и фазово-контрастной микроскопии превращаются в области изменения интенсивности света, в то время как при дифференциальном интерференционном контрасте они имеют вид светлой каймы. Использование контраста, создаваемого интерферометрическими методами, дает возможность очень точно измерить длину оптического пути по оси z и соответственно зафиксировать весьма малые различия в этом направлении. Эта техника позволяет также выявить градиенты длины оптического пути. При исследовании интерферометрическими методами кожицы

лука Калфински и Пэппелис [22] показали, что масса ядра на единицу площади составляет 1 Х 10-14 г/мкм2, а общая масса — 14 X 10-10 г.

Плоскополяризованный свет выявляет области плеохроизма, в то время как скрещенные поляризаторы создают контраст между изотропными и анизотропными областями. Дополнительные приспособления дают возможность сравнивать направления двулучепреломления с помощью цветовых различий. В препарате клеток кожицы лука на фоне изотропной цитоплазмы будут отчетливо выделяться высокоупорядоченные кристаллоподобные стенки клеток, а при использовании чувствительной цветной пластинки при любой ориентации препарата продольные и поперечные стенки будут окрашены в различные цвета. Поглощение света ядрами и вертикальными клеточными стенками делает их контрастными в светлопольном изображении. Кожица лука не имеет аутофлуоресценции, но путем окраски флуорохромами можно выявить физикохимические различия в препарате. При использовании фазового, и, в особенности, дифференциального интерференционного контраста становятся видимыми цитоплазматические гранулы, и можно наблюдать их движение на периферии клетки.

Рис. 2.6. Схематическое трехмерное изображение клетки кожицы лука относительно направления световых лучей в микроскопе и положения глаза наблюдателя. Вверху— вид, клетки с поверхности (рис. 2.7). Внизу. 1. Вертикальные стенки вдоль оси г, короткие в случае а и длинные в случае б. 2. Горизонтальные стенки, расположенные в плоскости столика микроскопа. Верхние стенки, а —наружная и б —внутренняя поверхности. 3. Нижняя горизонтальная стенка, с — внутренняя поверхность клетки, б — наружная. 4. Ядро с ядрышком (4а). 5. Цитоплазма с гранулами. 6. Вакуоль.

40

Рис. 2.7. Вид живых клеток эпидермиса кожицы лука при различных способах освещения. А. DIC-изображение при направлении сдвига по оси (северо-восток-юго- запад). Б. DIC-изображение, когда направление сдвига (CВ — ЮЗ) параллельно длинным стенкам. В. Фазово-контрастное изображение того же поля зрения, что на А. Г. Интерференция по Жамину-Лебедеву на микроскопе Бейкер-Смита с двойным фокусом с объективом X40. Д. 1 темнопольное изображение в проходящем свете (шкала 100 мкм). Е. Темнопольное изображение в падающем свете.

Таблица 2.18. Вид клеток кожицы луковицы при различных способах микроскопий

41

*Ни одна из указанных методик не позволяет увидеть вакуоли (6) в цитоплазме. Рисунок получен с препарата, подвергнутого плазмолизу цитоплазмы. Для этого препарат заливают в среду (например, 2% раствор морской соли), осмотическое давление которой превышает осмотическое давление клеточного сока.

**Другие способы могут включать метод AVEC-DIC для проходящего света (гл. 8, [5]) или использование падающего света на напыленных пластиковых репликах, что позволяет увидеть соответственно цитоплазматические микротрубочки и конфигурацию поверхности горизонтальных стенок

В темном поле отчетливо видны границы изменения коэффициента преломления, поэтому вертикальные стенки и ядра выглядят яркими на темном фоне.

Горизонтальные клеточные стенки нельзя увидеть ни при каких способах просвечивающей микроскопии, хотя возможно, что слабое двулучепреломление будет видно сквозь скрещенные поляроиды. Горизонтальные стенки слишком прозрачны, поэтому исследования в проходящем свете для них не подходят. Светлое поле не годится, поскольку стенки не обладают достаточным отражением. Метод темного поля в проходящем свете дает относительно меньше рассеянного света (рис. 2.7, Е), и стенки становятся видимыми в форме куполов, идущих от центра к продольным границам клеток. Возможно, новые разработки в конфокальной микроскопии облегчат наблюдение таких структур.

Кожица лука была выбрана в качестве иллюстрации потому, что она выглядит по-разному при использовании различных методов. Хотя автор еще не пытался рассматривать ее с помощью отражательной интерференционной микроскопии, он полагает, что никаких новых деталей таким способом выявить в кожице лука не удастся. Другим, более старым методом является изготовление пластиковых реплик кожицы с последующим напылением металла или просто вакуумное напыление самой поверхности кожицы, которое повышает ее отражающие свойства и используется для выявления деталей при просвечивающей микроскопии.

Здесь уместно будет сделать предостережение. Вы можете в самом деле хорошо знать, как выглядит ваш препарат при использовании какого-либо одного метода контрастирования, но при этом не стремиться испытать другой метод, однако всегда полезно спросить себя, а как выглядит препарат при других методах наблюдения? На первых порах вы можете быть сильно расстроены или разочарованы, но следуя принципам, изложенным в настоящей главе, вы должны понимать, что новое изображение дает новую информацию о физико-химической природе вашего препарата. Если при повторных исследованиях у вас получается одно и то же изображение, то скорее всего на него следует обратить внимание. Нужно пробовать разные методы и проводить с их помощью сравнительные исследования препаратов.

Благодаря созданию эпифлуоресцентных приставок, устанавливаемых на микроскопы проходящего света, стало возможным совместное применение двух методов. Оно может быть очень полезным, например для локализации в клетках или тканях флуоресцирующих областей по отношению к нефлуоресцирующим. Два метода могут использоваться одновременно или последовательно без переставления препарата, достаточно лишь передвинуть шторку эпиосвещения и увеличить интенсивность проходящего света за счет накала лампы. Примером может служить работа Нильсона и др. [23], где флуоресценция и фазовый контраст использовались для демонстрации связи кальмодулина с лизосомами.

Препарат может преподнести неожиданность даже при использовании лучших способов контрастирования и максимальных в световой микроскопии увеличений. Явление, которое часто встречается, особенно при наблюдении объектов, имеющих периодическую структуру, например панцирей диатомовых водорослей,— это муаровый рисунок. Он может быть следствием того, что две одинаковые пластинки накладываются друг на

42