22. Методы культивирования вирусов. Вирусологический метод, основные этапы.

Вирусологический метод состоит из данных этапов:

1. Отбор и обработка материала для исследования. Исследуемый материал (фекалии, носоглоточные смывы, секционный материал, спинномозговая жидкость, кровь моча и т.д. – зависит от характера заболевания) центрифугируют, фильтруют, обрабатывают для подавления бактериальной и грибковой микрофлоры антибиотиками, добавляют к смеси гептан и фреон. Отбор проводится в ранние сроки заболевания при соблюдении правил, предотвращающих контаминацию материала посторонней микрофлорой и инфицирование медицинского персонала. Для предупреждения инактивации вирусов при транспортировке материала, он помещается в вирусную транспортировочную среду (ВТС), состоящую из сбалансированного солевого раствора,

антибиотиков и сывороточного альбумина. Транспортируется материал в специальном контейнере с термоизоляцией и закрытыми пластиковыми пакетами, содержащими лед.

2.Заражение серии:

·Куриных эмбрионов (КЭ)

Для успешного культивирования вирусов в КЭ требуется определенный температурный режим (36-38С), влажность (50-70%) и достаточная вентиляция. Заражают куриные эмбрионы определенного возраста, инкубированные от 6 до 13 дней. Перед заражением куриные эмбрионы овоскопируют: определяют их жизнеспособность, отмечают на скорлупе границу воздушного мешка и месторасположение эмбриона («темный глаз» эмбриона). Работа с куриными эмбрионами проводится в стерильном боксе стерильными инструментами (пинцеты, шприцы, ножницы, копье и др.). После выполнения фрагмента работы инструменты погружают в 70 % этиловый спирт и перед следующей манипуляцией прожигают. Перед заражением скорлупу куриного эмбриона протирают горящим спиртовым тампоном и спиртовым раствором йода. Объем исследуемого материала, вводимого в эмбрион, составляет 0,1-0,2 мл. Для выделения вирусов из одного материала используют не менее 4 куриных эмбрионов. Могут производит заражение на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, в полость амниона, в желточный мешок.

·Культур клеток

Для успешного получения клеточных культур и последующего размножения в них вирусов культивируемые клетки должны постоянно находиться в сбалансированной среде, содержащей все необходимые компоненты для их жизнедеятельности и размножения. Для этой цели используют солевые растворы и вирусологические питательные среды. Нередко добавляются антибиотики, чтобы избежать бактериального и грибкового заражения. Вирусологические питательные среды – естественные питательные среды (солевые растворы Хенкса и Эрла + сыворотки + амниотическая жидкость + эмбриональные экстракты, напр., среда HeLa), ферментативные гидролизаты белковых веществ (напр., гидролизат лактальбумина + раствор Хенкса), синтетические питательные среды (напр., среда Паркера, среда Игла и т.д.).

·Лабораторных животных

Используются белые мыши, морские свинки, хомяки, кролики и др. Белые мыши наиболее чувствительны к большому числу видов вирусов. Способ заражения животных определяется тропизмом вируса к тканям. Заражение в мозг применяется при выделении нейротропных вирусов (вирусы бешенства, полиовирусы и др.). Интраназальное заражение проводят при выделении возбудителей респираторных инфекций. Широко используются внутримышечный, внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный и другие методы заражения. Заболевших животных усыпляют эфиром, вскрывают и производят забор материала из органов и тканей.

3.Оценивают феномены, указывающие на присутствие вируса

·Куриные эмбрионы – РГА, гибель, отставание в развитии, изменение оболочек

·Культуры клеток – ЦПД, образование бляшек, цветная проба Солка, гемадсорбция, интерференция, РГА, иммуннофлюоресценция

·Животные – заболевание, гибель, морфологические изменения в тканях

морфологических и тинкториальных свойств. Чаще используется окраска по Граму, которая позволяет в ряде случаев поставить этиологический диагноз (менингококковая инфекция, гонорея и др.) или по преобладанию в материале грам+ или грамфлоры выбрать соответствующий антибиотик широкого спектра действия для начала проведения антибактериальной терапии.

*максимальная определяемая концентрация бактерий в мазке из нативного материала - 105 кл./мл (количество микроорганизмов в единице объема исследуемого объекта) (это означает, что при необходимости выявления МО, находящихся в материале в меньших количествах, их предварительно нужно центрифугировать– при туберкулезе, менингококковой инфекции, или делать многослойные мазки, или предобогащение в культуральной среде – при трихомониазе; т.е. патологический процесс может иметь место, но метод не позволит увидеть возбудителей в мазке).

1)Световая микроскопия

Принцип работы: исследуются окрашенные клетки и ткани, для освещения применяются лучи видимого спектра, изображение создается за счет различий и степени поглощения света разными участками изучаемого окрашенного объекта, при прохождении луча через окрашенный объект происходит изменение интенсивности света, человеческий глаз улавливает изменения амплитуды световой волны.

Достоинства: техническая простота, недорогая стоимость, позволяет различить структуру и детали изучаемого объекта, если он состоит из частей с разной оптической плотностью без специальных доп. устройств

Недостатки: низкий контраст изображения, не видны объекты менее 200 нм

*окраска по Цилю-Нильсену используется для дифференцировки бактерии по строению клеточной стенки

2) Люминесцентная микроскопия

Принцип работы: мощный пучок света (из источника света, богатого ультрафиолетом) попадает на систему ультрафиолетовых светофильтров, фиолетовые и ультрафиолетовые лучи проходят через фильтр и, пройдя по оптической системе, попадают (фиолетовые на рисунке) на интерференционный светофильтр (серый на рисунке), расположенный над объективом под

углом 450. Последний не пропускает УФ-лучи и отражает их в объектив. Через объектив происходит освещение объекта, ранее окрашенного флюорохромом, возникает вторичная флюоресценция. Лучи вторичной флюоресценции (зеленым на рисунке) НЕ задерживаются интерференционным светофильтром и попадают в окуляр.

Достоинства: высокая контрастность, возможность использования специфичных методов микроскопии (реакция иммунофлюоресценции).

Недостатки: высокая стоимость.

3) Темнопольная микроскопия

Принцип работы: в микроскопе используется кардиоид-конденсор (или параболоид-конденсор), который не пропускает центральные лучи, для освещения используются боковые лучи, которые при отсутствии объекта не попадают в объектив (темное поле). При наличии объекта часть лучей, попадая на него, отражается в объектив, создавая яркое изображение.

Достоинства: возможность изучения живых микроорганизмов (изучения подвижности бактерий и простейших); отсутствие искажений, связанных с фиксацией и окраской препаратов.

Недостатки: сложная настройка освещения, высокие требования к качеству предметных и покровных стекол.

4) Фазово-контрастная микроскопия

Принцип работы: пучок света, проходящий сквозь неокрашенный препарат, меняет фазу колебания световой волны, но это колебание не воспринимается человеческим глазом. Фазовоконтрастный конденсор и фазовый объектив делают изображение контрастным, превращая фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные.

Достоинства: возможность изучения живых микроорганизмов (изучение подвижности бактерий и простейших); отсутствие искажений, связанных с фиксацией и окраской препаратов, возможно изучение внутренней структуры крупных объектов (ядра, вакуоли).

*нужен для изучения малоконтрастных объектов, невидимых в микроскоп при наблюдении в проходящем свете в световом поле

Недостатки: слабая контрастность получаемых изображений и наличие светящихся ореолов вокруг объектов.

5) Электронная микроскопия

эпителий трахеи (РЭМ – растровая) Поперечное сечение через жгутики хламидомонады (ПЭМ

– просвечивающая, или трансмиссионная)

Принцип работы:

1)сканирующая (растровая) ЭМ используется для изучения поверхности объекта, образцы покрываются пленкой металла, вместо света через объект пропускается пучок электронов; 2)трансмиссионная (просвечивающая) ЭМ используется для изучения внутреннего строения клетки, пучок электронов пропускается через объект, предварительно обработанный тяжелыми металлами, которые накапливаются в определенных структурах, увеличивая их электронную плотность, электроны рассеиваются на участках клетки с большей электронной плотностью, в результате чего на изображениях эти области выглядят темнее.

Достоинства: высокое разрешение (теоретически до 0,002 нм, практически до 2 нм), возможность изучения ультраструктур клеток

Недостатки: необходимо специальное техническое оснащение, техническая сложность, труднодоступность, дороговизна

*ОБЩИЕ ПОНЯТИЯ:

Увеличение (увеличительная способность оптической системы) – то, во сколько раз можно увеличить объект при сохранении четкости изображения. Рассчитывается как произведение объектива на увеличение окуляра.

Разрешение (разрешающая способность) – минимальное расстояние между двумя точками, на котором они еще воспринимаются отдельно. Разрешение здоровой оптической системы глаза

0,2 мм.

Для микроскопии готовят мазки (микропрепараты):

1)нативный – в физ.раствор на предметное стекло наносят суспензию исследуемого материала, покрывают сверху покровным стеклом;

2)фиксированный – обезжиривают предметное стекло, наносят каплю физ.раствора, петлей/зубочисткой/стеклянной палочкой готовят суспензию исследуемого материала, высушивают, фиксируют в пламени спиртовки или хим. веществом, окрашивают, промывают, высушивают.