Экзамен по микробиологии 2021
Блок 1
1. Аллергические пробы in vivo и in vitro, их сущность, применение.
Аллергические пробы – это биологические реакции, используемые для диагностики ряда заболеваний, основанные на повышенной чувствительности организма, вызванной аллергеном.
При многих инфекционных заболеваниях за счет активации клеточного иммунитета развивается повышенная чувствительность организма к возбудителям и продуктам их жизнедеятельности. В некоторых случаях инфекция может быть единственным фактором сенсибилизации, являясь причинно-значимым аллергеном и источником аллергического заболевания. В других случаях, при полисенсибилизации, инфекционные аллергены могут быть одним из многих этиологических факторов. Аллергические пробы помогают выявить наличие бактериальных, вирусных, протозойных инфекций, микозов и гельминтозов (нередко они бывают положительными у переболевших и привитых).
Все аллергические пробы подразделяют на две группы — пробы in vivo и in vitro. К первой группе относятся кожные пробы, осуществляемые непосредственно на пациенте. Аллергические пробы in vitro основаны на выявлении сенсибилизации вне организма больного. Их применяют тогда, когда по тем или иным причинам нельзя произвести кожные пробы, либо в тех случаях, когда кожные реакции дают неясные результаты.
Для проведения аллергических проб используют аллергены. Инфекционные аллергены представляют собой очищенные фильтраты бульонных культур, реже взвеси убитых м/о или АГ, выделенные из них.
Кожные пробы: Прик-тест; Внутрикожная; Скарификационная и Аппликационная пробы.
Основным методом кожного тестирования при специфической аллергодиагностике является проба уколом (prick – укол). Этот метод аллергодиагностики принят повсеместно.
Внутрикожные пробы более чувствительны, чем скарификационные, но и менее специфичны. Применяют их для выявления сенсибилизации к аллергенам бактериального и грибкового происхождения. Техника выполнения: в среднюю треть передней поверхности предплечья специальной тонкой иглой вводят 0,1 мл аллергена.
Скарификационные тесты отличаются довольно высокой специфичностью, но всё-таки они чаще могут давать ложноположительные реакции. Методика
постановки: накожно, путем втирания аллергена в скарифицированные (поврежденные) участки кожи.
Методика постановки аппликационной пробы: на кожу предплечья наносят каплю аллергена или накладывают кусочек марли, смоченный раствором аллергена, фиксируют ее лейкопластырем.
Во всех тестах доп. ставят пробы с тест-контрольной жидкостью – отрицательный контроль, например, изотонический р-р хлорида натрия; и гистамином в качестве положительного контроля. Результаты учитывают по величине папулы, наличию отека и зуда.
Кожные пробы на наличие ГЗТ широко применяют для выявления инфицированности людей микобактериями туберкулеза (проба Манту), возбудителями бруцеллеза (проба Бюрне), лепры (реакция Митсуды), туляремии, сапа, актиномикоза, дерматомикозов, токсоплазмоза, некоторых гельминтозов и др.
Пробы in vitro – анализ крови на аллергию.
Эти методы исследования безопасны для больного, достаточно чувствительны, позволяют
количественно оценить уровень реактивности организма. В настоящее время разработаны тесты для определения сенсибилизации, основанные на реакциях Т- и B- лимфоцитов, тканевых базофилов, выявлении общих специфических IgE в сыворотке крови и др.
Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ). Сенсибилизированные к определенному АГ лимфоциты резко снижают скорость подвижности в среде, в
которую вносят этот АГ. Реакция осуществляется при непосредственном взаимодействии АГ-специфических рецепторов с АГ, а также через воздействие фактора, ингибирующего миграцию клеток, выделяющегося при контакте со специфическим АГ. Показатель торможения миграции выражают в процентах по сравнению с контролем (сравнивается площадь миграции). Уменьшение площади миграции свидетельствует о наличии фактора, ингибирующего ее.
Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТ). В основе этой реакции лежит способность нормальных лимфоцитов периферической крови вступать в митоз и превращаться в бластные формы (юные) при культивировании их in vitro под действием специфических факторов — аллергенов. К лимфоцитам, выделенным из крови пациента, добавляются радиоактивная метка Н3-тимидин.
Реакция специфического розеткообразования. Розетки — характерные образования,
возникающие in vitro в результате прилипания эритроцитов к поверхности иммунокомпетентных клеток. Тимусзависимые Т-лимфоциты и др.
иммунокомпетентные клетки имеют рецепторы для эритроцитов барана (CD2 АГ), которые выступают, таким образом, маркером для их распознавания. Этот феномен воспроизводится также и в том случае, если используют эритроциты, на которых фиксированы соответствующие аллергены.
Реакция дегрануляции тканевых базофилов. Методика основана на том, что под действием аллергена происходит дегрануляция тканевых базофилов крысы, предварительно сенсибилизированных цитофильными AT из сыворотки крови больного.
Базофильный тест Шелли. Известно, что базофильные гранулоциты человека или кролика дегранулируются в присутствии сыворотки больного и аллергена, к которому чувствителен данный пациент. Базофильные лейкоциты крови подобно тканевым тучным клеткам принимают участие в освобождении гистамина, гепарина, медленно реагирующей субстанций и серотонина. Считают, что реакция дегрануляции базофилов крови свидетельствует о наличии реакции аллерген — АТ.
Определение АТ класса IgE in vitro. Лабораторная диагностика заболеваний, в основе которых лежит ГНТ, основана на определении аллергенспецифических IgE. При использовании радиоактивной метки метод носит название радиоаллергосорбентного теста (PACT), но чаще в качестве метки используют фермент или флюоресцирующее вещество (ФАСТ). Время анализа — 6 — 7 ч. Принцип метода: фиксированный на твердой основе известный аллерген инкубируют с сывороткой крови больного; находящиеся в сыворотке специфические IgE связываются с аллергеном и, таким образом, остаются фиксированными на основе и могут вступать в специфическое взаимодействие с добавляемыми мечеными анти-IgE.
2. Анатоксины. Получение, применение. Антитоксический иммунитет
В 1923 г. Глени и Рамон обнаружили возможность превращения бактериальных экзотоксинов под влиянием формалина в нетоксичные вещества - анатоксины, обладающие антигенными свойствами. Это позволило использовать анатоксины в качестве вакцинных препаратов.
Анатоксины – препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, полностью лишенные своих токсических свойств, но сохранившие антигенные и иммуногенные свойства.
Получение: токсигенные бактерии выращивают на жидких средах, фильтруют с помощью бактериальных фильтров для удаления микробных тел, к фильтрату добавляют 0,4% формалина и выдерживают в термостате при 30-40t на 4 недели до полного исчезновения токсических свойств, проверяют на стерильность, токсигенность и иммуногенность. Эти препараты называются нативными анатоксинам, в настоящее время почти не используются, т. к. содержат большое количество балластных веществ, неблагоприятно влияющих на организм. Анатоксины подвергают физической и химической очистке,
адсорбируют на адъювантах. Такие препараты называются адсорбированными высокоочищенными концентрированными анатоксинами.
Титрование анатоксинов в реакции фолликуляции производят по стандартной фолликулирующей антитоксической сыворотке, в которой известно количество антитоксических единиц. 1 антигенная единица анатоксина обозначается Lf, это то количество анатоксина, которое вступает в реакцию флокуляции с 1 единицей дифтерийного анатоксина.
Применение: Анатоксины применяются для профилактики и реже, для лечения токсинемических инфекций (дифтерия, газовая гангрена, ботулизм, столбняк). Так же анатоксины прим
еняются для получения антитоксических сывороток путем гипериммунизации животных. Примеры препаратов: АКДС, АДС, адсорбированный стафилококковый анатоксин, ботулинистический анатоксин, анатоксины из экзотоксинов возбудителей газовых инфекций.
Цель применения анатоксинов — индукция иммунных реакций, направленных на нейтрализацию токсинов; в результате иммунизации синтезируются нейтрализующие AT (антитоксины). Обычный источник токсинов — промышленно культивируемые естественные штаммы-продуценты (например, возбудители дифтерии, ботулизма, столбняка). Полученные токсины инактивируют термической обработкой либо формалином, в результате чего образуются анатоксины (токсоиды), лишённые токсических свойств, но сохранившие иммуногенность. Анатоксины очищают, концентрируют и для усиления иммуно-генных свойств адсорбируют на адъюванте (обычно, гидрооксид алюминия). Адсорбция анатоксинов значительно повышает их иммуногенную активность. С одной стороны, образуется депо препарата в месте его введения с постепенным поступлением в кровоток, с другой — действие адъюванта стимулирует развитие иммунного ответа, в том числе и в регионарных лимфатических узлах. Анатоксины выпускают в форме моно- (дифтерийный, столбнячный, стафилококковый) и ассоциированных (дифтерийно-столбнячный, ботулинический трианатоксин) препаратов.
Дополнительно: Научная электронная библиотека (monographies.ru)
Антитоксический иммунитет – отдельные бактерии в организме выделяют токсины, на которые вырабатываются антитела, нейтрализующие токсины в организме животного. Иммунитет антитоксический – невосприимчивость организма к инфекционным болезням, возбудители которых продуцируют экзотоксины. Иммунитет антитоксический достигается активной иммунизацией, введением в организм анатоксина, вызывающего синтез антитоксинов, антитоксических сывороток или пассивной иммунизацией. Содержание антитоксинов в антитоксических сыворотках выражается в антитоксических единицах (АЕ). О напряженности антитоксического иммунитета можно судить по содержанию антитоксинов в сыворотке крови. Антитоксический и антимикробный иммунитет. Различают антитоксический иммунитет, направленный на нейтрализацию
микробных ядов, и антибактерийный иммунитет, направленный на уничтожение самих микробных тел. В наиболее чистом виде антитоксический иммунитет проявляется при токсических инфекциях (дифтерия, столбняк, ботулизм, газовая гангрена и др.).
В механизме антитоксического иммунитета имеет значение не только наличный титр антитоксинов в крови иммунного человека или животного, но и способность организма к их выработке.
Конспект преподавателя:
Генетические рекомбинации — это взаимодействие между двумя молекулами ДНК, обладающими различными генотипами, которое приводит к образованию рекомбинантной ДНК, сочетающей гены обоих молекул. Особенности рекомбинации у бактерий определяет отсутствие полового размножения и мейоза, в процессе которых у высших организмов происходят рекомбинация, а также гаплоидный набор генов.
В процессе рекомбинации бактерии условно делятся на клетки-доноры, которые передают генетический материал, и клетки-реципиенты, которые воспринимают его. В клеткуреципиент проникает не вся, а только часть хромосомы клетки-донора, что приводит к формированию неполной зиготы — мерозиготы. В результате рекомбинации в мерозиготе образуется только один рекомбинант, генотип которого представлен в основном генотипом реципиента,
По молекулярному механизму генетическая рекомбинация у бактерий делится на гомологичную, сайтспецифическую и незаконную.
При гомологичной рекомбинации в процессе разрыва и воссоединения ДНК происходит обмен между участками ДНК, обладающими высокой степенью гомологии. Процесс гомологичной рекомбинации находится под контролем генов, объединенных в RЕС - систему.
Сайтспецифическая рекомбинация - этот тип рекомбинации не зависит от функционирования RЕС –генов, не требует протяжных участков гомологии ДНК, но для протекания которой необходимы строго определенные последовательности ДНК и специальный ферментативный аппарат, специфичный для каждого конкретного случая. Примером этого типа рекомбинации является встраивание плазмиды в хромосому бактерий, которое происходит между идентичными IS-элементами хромосомы и плазмиды, интегра-ция ДНК фага лямбда в хромосому Е. coli.
Незаконная или репликативная рекомбинация - также не зависит от функционирования генов RЕС. Примером ее является транспозиция подвиж-ных генетических элементов по репликону или между репликонами, при этом, транспозиция подвижного генетического элемента сопровождается репликацией ДНК.
Генетические рекомбинации могут осуществляться путем трансформации, трансдукции, конъюгации, слияния протопластов.
Трансформация - процесс трансформации может самопроизвольно происходить в природе у некоторых видов бактерий, В. subtilis, И, influenzae, S. pneumoniae, когда ДНК,
выделенная из погибших клеток, захватывается реципиентными клетками. Процесс трансформации зависит от компетентности клетки-реципиента и состояния донорской трансформирующей ДНК. Компетентность — это способность бактериальной клетки поглощать ДНК.
Она зависит от присутствия особых белков в клеточной мембране, обладающих специфическим аффинитетом к ДНК. Состояние компетентности у грам положительных бактерий связано с определенными фазами кривой роста. Состояние компетенции у грамотрицательных бактерий приходится созда-вать искусственным путем, подвергая бактерии температурному или элек-трошоку.
Трансформирующей активностью обладает только двунитевая высокос-пирализованная молекула ДНК. Это связано с тем, что в клетку-реципиент проникает только одна нить ДНК, тогда как другая — на клеточной мембране — подвергается деградации с высвобождением энергии, которая необходима для проникновения в клетку сохранившейся нити. Высокая молекулярная масса трансформирующей ДНК увеличивает шанс рекомбинации, так как внутри клетки трансформирующая нить ДНК подвергается воздействию эндонуклеаз. Интеграция с хромосомой требует наличия гомологичных с ней участков у трансформирующей ДНК. Рекомбинация происходит на одной нити, в результате чего одна нить имеет генотип реципиента, а другая — рекомбинантный генотип. Рекомбинантные трансформанты формируются только после цикла репликации.
Конъюгация – осуществляется при непосредственном контакте клеток. Контролируется tra- (transfer) опероном. Главную роль играют конъюгативные F- плазмиды, которые кодируют половые пили, образующие конъюгационный мостик (трубочку) между клеткой-донором и клеткой-реципиентом, по которой плазмидная ДНК передается в клетку-реципиент. Если F-фактор находится в клетке-доноре в автономном состоянии, то в результате взаимодействия клетка-реципиент приобретает донорские свойства. Если F- фактор или другая трансмиссивная плазмида встраиваются в хромосому клеткиреципиента, то плазмида и хромосома начинают функционировать в виде единого трансмиссивного репликона, что делает возможным перенос бактериальных генов в бесплазмидную клетку-реципиент.
Трансдукция – это передачу бактериальной ДНК посредством бакте-риофага. В процессе репликации фага внутри бактерий фрагмент бактериальной ДНК проникает в фаговую частицу и переносится в реципиентную бактерию во время фаговой инфекции. Существует два типа трансдукции: общая трансдукция — перенос бактериофагом сегмента любой части бактериальной хромосомы — происходит вследствие того, что в процессе фаговой инфекции бактериальная ДНК фрагментируется, и фрагмент бактериальной ДНК того же размера, что и фаговая ДНК, проникает в фаговую головку, формируя дефектную фаговую частицу – умеренный бактериофаг. Этот процесс