2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)

Вирус чумы свиней снижает инфекционную активность вируса ящура, вирус ньюкаслской болезни - вируса везикулярного стоматита и т. д.

Обычно этот метод применяют для обнаружения вирусов, которые не вызы-

вают ЦПД в культурах клеток. Так, для обнаружения вируса чумы свиней в куль-

турах (он не вызывает ЦПД) эту инфицированную культуру заражают вторым ви-

русом (ящура) в дозе не менее 100 ЦПД50 и инкубируют в термостате при 37 °С.

Через несколько дней проводят учет под микроскопом. Если в культуре клеток не обнаруживают ЦПД, значит, в ней находится вирус чумы свиней. Если во всех пробирках ЦПД, значит, вируса чумы нет и вирус ящура проявляет цитопатоген-

ное действие. Метод интерференции используют даже для титрования вирусов не вызывающих ЦПД.

Перечень контрольных вопросов:

1.Первично-трипсинизированные культуры клеток.

2.Субкультуры.

3.Перевиваемые культуры клеток.

4.Диплоидные культуры клеток.

5.Суспензионные культуры клеток.

6.Замораживание культур клеток.

7.Восстановление культур клеток.

8.Растворы Хенкса, Эрла, трипсина и версена.

9.Питательные среды: ростовые, поддерживающие.

10.Заражение культур клеток.

11.Симпластообразование.

12.Округление культур.

13.Фрагментация культур.

Тема 1.6. Титрование вирусов

Цель: изучить способы определения концентрации вируса в материале.

Содержание:

 Инфекционные единицы локальных повреждений;

71

инфекционные единицы 50 % действия на тест-объекты;

гемагглютинирующие единицы.

Количество вируса в материале определяют по титру вируса в этом мате-

риале, т.е. выражение его концентрации в материале. Титр вируса - это количе-

ство вируса, содержащееся в единице объема материала. Т.к. количество виру-

са нельзя выразить в обычных (объем, масса) единицах, его измеряют в ЕД или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглюти-

нирующие.

Три типа единиц количества вируса:

-инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту;

-инфекционные единицы 50 % действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статистически;

-гемагглютинирующие единицы.

Из локальных повреждений выделяют бляшки в зараженных культурах кле-

ток (измеряют в бляшкообразующих единицах - БОЕ) и оспины (некротические узелки) на хориоаллантоисной оболочке (ХАО) куриных эмбрионов, зараженных оспенными и некоторыми другими вирусами (оспообразующих единицах - ООЕ).

Одна БОЕ равна дозе вируса, способной вызвать образование одной бляшки, а

одна ООЕ равна дозе вируса, способной вызвать образование одной оспины.

Определение титра вируса в БОЕ или ООЕ. Точно отмеренными и строго одинаковыми объемами исследуемого вируссодержащего материала заражают не-

сколько культур клеток в матрасах или куриные эмбрионы на ХАО. Затем под-

считывают, сколько образовалось в каждом матрасе бляшек или в каждом эм-

брионе оспин, и рассчитывают среднее арифметическое этого количества. Оно точно равно количеству БОЕ или ООЕ вируса, содержащегося в заражающей дозе вируссодержащего материала. Т.к. объем заражающей дозы точно известен, не-

трудно рассчитать, сколько БОЕ или ООЕ приходится на единицу объема вирус-

72

содержащего материала. Это и будет титром вируса в материале. Рассчитать титр

вируса (Т) можно по формуле:

где n - среднее арифметическое количество бляшек на один матрас или оспин на один куриный эмбрион; V - объем заражающей дозы; а - разведение вируссо-

держащего материала, взятое для заражения.

Пример. Необходимо определить титр вируса оспы кур в суспензии из кусочков пораженной кожи больных оспой кур. Т.к. суспензия получилась довольно концентрированная и вязкая, отобрали 0,5 мл этой суспензии и добавили к ней 4,5 мл физиологического раствора, т.е. развели в 10 раз (1:10). По 0,2 мл разведенной суспензии внесли на ХАО пяти куриных эмбрионов. Через 6 дней инкубации в термостате эмбрионы вскрыли и сосчитали количество оспин на всех пяти ХАО. Их оказалось 10, 11, 13, 18 и 8. Среднее арифметическое:

n = (10 + 11 + 13 + 18 + 8) : 5 = 12

Полученные результаты (n = 12 оспин, V=0,2 мл, а=1:10=0,1) подставим в формулу

Т = 12 : ( 0,2 × 0,1) = 12 : 0,02 = 12 × 100 : 2 = 600

Следовательно, титр вируса в суспензии равен 600 ООЕ/мл, т.е. в каждом мл суспензии содержится по 600 доз вируса оспы, каждая из которых способна вызвать образование одной оспины на ХАО.

Этот пример титрования вируса - упрощенный, т.к. не учитывает случаев высо-

кой концентрации вируса в материале, при которой бляшки в культурах клеток или оспины на ХАО могут сливаться между собой и их невозможно будет сосчитать.

Считается, что счету поддаются бляшки (оспины), если их количество не превы-

шает 50 на матрас (ХАО). Поскольку титр вируса в исследуемом материале неиз-

вестен (его определяют), трудно сказать, в каком разведении надо брать материал для заражения, чтобы избежать слияния бляшек (оспин). Поэтому готовят не-

сколько разведений испытуемого материала (обычно с коэффициентом 10) и каж-

73

дым разведением в одинаковых дозах заражают равные группы культур клеток

(куриных эмбрионов), затем рассчитывают среднее арифметическое количество бляшек (оспин) для каждого разведения, отбрасывая те, где счет оказался невоз-

можным. Титр вируса тогда рассчитывают по формуле

Пример результатов титрования приведен ниже.

Метод титрования вирусов в БОЕ дает достоверные данные о концентрации вирусов, но трудность заключается в получении и подсчете бляшек. Наиболее универсален метод определения титра вируса в единицах 50 % инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50 % зараженных тест-

объектов. Она обозначается как ЭД50 - эффективная 50 % доза. Число таких доз

вируса в единице объема материала выражает титр вируса в этом материа-

ле. В качестве тест-объектов используют белых мышей, куриные эмбрионы и культуры клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться гибелью, клиникой, патологоанатомическими изменениями и ЦПЭ. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект и форму учета его инфек-

74

ционного действия, по которой оценивают эффект заражения. В зависимости от вида тест-объекта и формы проявления инфекционного действия ЭД50 принимает один из следующих видов, приведенных в таблице.

Иначе говоря:

1 ЛД50 - это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей);

1 ИД50 - доза вируса, вызывающая клинику или патологоанатомические изме-

нения у 50 % зараженных лабораторных животных;

1 ЭЛД50 - доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;

1 ЭИД50 - доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50

% зараженных куриных эмбрионов;

1 ЦПД50 - доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % заражен-

ных культур клеток (обычно пробирок с культурами).

Количество ЭД50 (ЛД50, ИД ЭЛД50, ЭИД50 или ЦПД50) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=103,48 ЦПД50/0,1 мл означает, что в каждой

0,1 мл вируссодержащего материала содержится 103,48 доз вируса (т.е. более 1000,

но менее 10000, а именно 103,48 = 3020), каждая из которых способна вызвать ЦПЭ в 50 % пробирок с культурами.

Названные единицы 50 % инфекционного действия вируса (ЛД50, ИД50,

ЭЛД50, ЭИД50, ЦПД50) используются при оценке инфекционного действия вируса

75

со статистически оцениваемым эффектом, когда учет инфекционного действия вируса ведется по летальному действию, клинике, патологоанатомическим изме-

нениям или ЦПД.

Титрование вирусов по 50 % инфекционному действию - наиболее универ-

сальный прием, пригодный для титрования любого вируса, если подобрать чувст-

вительную к нему живую систему (текст-объект). Но этот метод титрования тру-

доемкий, длительный и требует статистических расчетов.

Задача определения титра вируса в единицах 50 % инфекционного действия

(ЛД50, ИД50, ЭЛД50, ЭИД50, ЦПД50) сводится к тому, чтобы найти такое разведение ис-

пытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого со-

держалась бы 1 ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала, что и будет показателем титра ви-

руса в этом материале. Для этого сначала из исследуемого вируссодержащего ма-

териала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений (т.к. облегчаются последующие расчеты).

Одинаковыми объемами каждого из 10-кратных разведений исследуемого вируссодержащего материала заражают равные группы чувствительных к дан-

ному вирусу живых тест-объектов (мышей, куриных эмбрионов или культур кле-

ток). При этом в каждой группе должно быть не менее 4-6 тест-объектов, т.к. при меньшем количестве статистически рассчитываемая величина титра вируса будет иметь слишком большую погрешность (статистическая величина тем точнее, чем на большем количестве исходных данных она основана).

После заражения учитывают результат действия вируса (гибель, клинику,

патологоанатомические изменения или ЦПЭ) на зараженные объекты и опреде-

ляют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Разведение, дающее 50 % эффект, рассчитывают методом пря-

молинейной интерполяции. Когда такое разведение нашли, то считают, что в за-

ражающем объеме вируса, разведенного в найденное (соответствующее 50 %

эффекту) число раз, содержится 1 ЭД50. В таком же объеме исходного (неразве-

денного) вируссодержащего материала таких доз (ЭД50) содержится больше во

76

столько раз, во сколько был разведен материал, давший 1 ЭД50. Затем пересчи-

тывают, сколько таких единиц 50 % инфекционного действия вируса содержится в единице объема (мл) вируссодержащего материала, что и будет выражением титра вируса в данном материале.

Разберем сказанное на конкретном примере. Предположим, что мы полу-

чили 12 мл суспензии вируса эктромелии белых мышей и путем бактерио-

логического контроля убедились, что она свободна от бактерий и грибов. Наша за-

дача - установить титр вируса в указанной суспензии. Вначале подбираем лабора-

торную живую систему, чувствительную к данному вирусу. Выясняем, что вирус эктромелии убивает мышей при внутрибрюшинном заражении. Поэтому решаем титровать вирус в нашей суспензии на белых мышах. Для этого подбираем 60

мышей, равных по массе и без признаков какого-либо заболевания. По 6 мышей рассаживаем в 10 клеток (или широкогорлые банки объемом 10 л), каждую из ко-

торых нумеруем. Затем из исследуемой суспензии вируса готовим ряд последова-

тельных 10-кратных разведений. Количество разведений зависит от предполагае-

мого титра вируса (чем он выше, тем больше нужно сделать разведений). Их надо получать столько, чтобы последнее (наиболее высокое) разведение уже не давало инфекционного эффекта совсем. Но если вероятные пределы титра вируса пред-

положить трудно, то лучше сделать больше разведений, т.к. лишние разведения не помешают определению титра вируса, а в случае, если последнее разведение не даст нулевого эффекта, титр вируса определить будет невозможно. В соответст-

вии с величиной предполагаемых разведений берут и количество лабораторных объектов, на которых будут титровать вирус (в нашем примере мы решили делать

10 разведений вируса и соответственно разделили мышей на 10 групп по 6 в каж-

дой).

Чтобы получить 10 последовательных разведений исследуемой суспензии вируса, надо взять 10 стерильных пробирок с пробками (в штативе), пронумеровать их и в каждую налить по 9 мл стерильного физиологического раствора, а затем в первую пробирку внести пипеткой ровно 1 мл исследуемой суспензии, выдув ее так, чтобы не касаться концом пипетки поверхности физиологического раствора, и

77

удалить в сосуд с дезинфицирующим раствором (3 % гидроксид натрия или ка-

лия). Взять новую стерильную пипетку и с ее помощью, несколько раз набирая и выдувая жидкость, тщательно перемешать смесь в первой пробирке, набрать 1 мл смеси и внести во вторую пробирку, не касаясь поверхности физиологического раствора. Затем взять третью стерильную пипетку, перемешать ею смесь во вто-

рой пробирке и перенести ею 1 мл из второй в третью пробирку, и так повторять до десятой пробирки. В результате получим ряд последовательных 10-кратных разве-

дений суспензии вируса.

Наливать в пробирки по 9 мл физиологического раствора и затем последова-

тельно переносить по 1 мл необязательно. Можно эти объемы уменьшить в 2,5

или 10 раз, т.е. разлить по 4,5 мл физиологического раствора и переносить по 0,5

мл, или разлить по 1,8 мл физиологического раствора и переносить по 0,2 мл, или разлить по 0,9 мл физиологического раствора и переносить по 0,1 мл. Но надо помнить, что чем меньше используемые объемы, тем ниже точности отмеривания и определения титра вируса.

Процесс получения последовательных 10-кратных разведений можно пред-

ставить следующей схемой.

После получения разведений суспензии вируса необходимо выбрать дозу за-

ражения (должна быть технически удобной и обеспечить эффект заражения). Т.к.

лабораторные объекты обычно мелкие, то дозу заражения выбирают небольшую.

Для мышей 0,1-0,5 мл. Предположим, решили каждой мыши ввести внутрибрю-

шинно 0,3 мл инфекционного материала, т.е. суспензию вируса в различных раз-

78

ведениях. Тогда 0,3 мл суспензии вируса первого разведения (10-1, или 1:10) надо ввести 6 мышам первой группы, 0,3 мл разведения 10-2 (1:100) - второй и т. д.

За зараженными мышами устанавливают регулярное (не реже 1 раза в сутки)

наблюдение и фиксируют их гибель. Гибель в первые 48 ч после заражения счита-

ют неспецифической и в расчет не принимают. Когда падеж зараженных мышей прекращается, т.е. в течение 2-3 суток не будет новых случаев гибели, учет можно считать законченным. Результаты эксперимента фиксируют в журнале.

Предположим, что мы получили следующие результаты:

Теперь надо расчетным путем найти разведение вируса (это равно его дозе),

которое вызывает гибель 50 % зараженных мышей. Для этого известно много спо-

собов (в том числе и графических), но наиболее часто пользуются методом Рида и Менча или методом Кербера (оба способа дают погрешности и не являются наи-

лучшими).

Расчет дозы (разведения) вируса, дающей 50 % эффект (ЭД50), по Риду и Менчу. Этот метод предусматривает использование кумулятивных данных, кото-

рые получают, исходя из предположения, что мышь, выжившая при заражении определенной дозой (разведением) вируса, от заражения меньшей дозой обяза-

тельно бы выжила. И наоборот, мышь, павшая от заражения определенным разве-

дением вируса, обязательно пала бы от заражения меньшим разведением (боль-

шей дозой) вируса. Количество выживших и павших при таком рассуждении уве-

личивают на каждое разведение путем суммирования с предыдущими, идя от

79

большего к меньшему. Посмотрим, как это получится для нашего примера. Для

этого результат надо записать в виде таблицы.

Для получения кумулятивных данных (кумуляция - накопление) берут колонку фактических данных с отрицательной реакцией на заражение (у нас колонка вы-

живших после заражения мышей) и идут от меньшего значения к большему. Будем считать, что от дозы 0,3 мл в разведении 10-1 ни одна мышь не выжила; от разве-

дения 10-4 выжило 4, но и одна, выжившая от 10-3, от 10-4 заведомо выжила бы (доза

10-4 меньше, чем 10-3), и ее приплюсовывают к 4. Для 10-5 выжило 5, но и одна, пе-

режившая 10-3, а также 4, пережившие 10-4, от 10-5 тоже выжили бы. Их всех приплю-

совывают к 5, фактически выжившим. Точно так же и для остальных разведений.

Для положительно реагирующих на заражение (у нас павших) рассуждения ведут в обратном порядке и также суммируют от меньшего значения к большему.

После получения кумулятивных данных рассчитывают процент положитель-

но реагирующих на заражение (в нашем примере павших) для каждого разведения

(например, для разведения 10-4 пало 3 и выжило 5, т.е. пало 3 из 8, что равно

(3:8)*100 = 37,5%).

Как видно из полученных результатов, 0,3 мл суспензии вируса ни в одном из взятых разведений не убивает ровно 50 % мышей. Такое разведение вируса (или до-

зу вируса, т.е. ЛД50) необходимо рассчитать.

Из таблицы видно, что 0,3 мл суспензии вируса в разведении 10-3 убивает бо-

лее 50 % (88,8 %), а в разведении 10-4 - меньше 50 % (37,5 %) мышей. Значит, ис-

80