2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)

1.4. Иммуноферментный анализ (ИФА)

Как альтернатива РИФ, в полевых условиях может применяться гистохими-

ческий вариант иммунофер-

ментного анализа, позволяю-

щий идентифицировать спе-

цифический антиген как в раз-

ложившемся, так и консерви-

рованном материале, к тому же для учета результатов теста достаточно светового микро-

с целью диагностики бешенства получил «Сендвич» - вариант твердофазного им-

муноферментного анализа, метод основан на сорбции антигена в разных разведе-

ниях на иммобилизированные специфические глобулины с последующим выяв-

лением антигена глобулинами конъюгированными с пероксидазой хрена. Кроме этого, в реакции используют как политак и моноклональные антитела, послед-

ним, несомненно, отдается большее предпочтение в связи с их специфичностью,

авидностью, стабильностью и отсутствием неспецифических реакций.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Одним из наиболее точных тестов детекции рабического антигена является полимеразная цепная реакция. Данный метод позволяет диагностировать бешен-

ство даже при наличии в материале хотя бы одного вириона. Метод используется для подтверждения результатов МФА и для определения вируса в слюне, лукови-

цах волос заднего отдела шеи и головы. ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с по-

мощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок,

так называемых праймеров.

141

Однако полимеразная цепная реакция еще недостаточно разработана для ру-

тинной диагностики бешенства и пока не нашла применения в лабораториях.

Реакция диффузной преципитации (РДП)

Применяют для обнаружения возбудителя в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспериментальной инфекции (биопроба).

Реакцию ставят на предметных стеклах, на которые наливают 2,5-3 мл расплав-

ленного 1,5 % агара. После застывания в агаре делают лунки диаметром 4-5 мм по трафарету, помещенному под предметное стекло с агаром. Агаровые столбики вынимают ученическим пером. Лунки в агаре заполняют компонентами.

От крупных животных исследуют все отделы головного мозга (левой и пра-

вой стороны), от средних (крысы, хомяки и др.) - какие-либо 3 отдела мозга, у

мышей - весь мозг. С помощью пинцета из мозга готовят пастообразную массу, которую и помеща-

ют в соответствующие лунки.

Контроли с положительным и отрицательным антигенами ставят на отдельном стекле по тому же трафарету.

После заполнения лунок компонентами пре-

параты помещают во влажную камеру и ставят в

термостат при 37 °С на 6 ч, затем при комнат-

Рисунок 49 - РДП на бешенство.

ной температуре - на 18 ч. Учет результатов ве-

дут в течение 48 ч.

Реакцию считают положительной при появлении одной или 2-3 линий пре-

ципитации любой интенсивности между лунками, содержащими суспензию мозга и антирабический гамма-глобулин (рисунок 49).

Бактериальная нестерильность и загнивание мозга не препятствуют исполь-

зованию его для РДП. Материал, консервированный глицерином, формалином и другими средствами, для РДП непригоден.

142

Выделение вируса in vitro на культурах клеток

Выделение вируса бешенства может быть необходимым для подтверждения результатов тестов по определению антигена и для более детальной характери-

стики изолятов. С этой целью широко используется культура клеток мышиной нейробластомы (Na C1300). Мозг суспендируют в культуральной питательной среде, суспензию наносят на монослой культуры клеток и инкубируют от одного до нескольких дней.

Чувствительность данной культуры к вирусу можно повысить обработкой ее ДЕАЕ декстраном. Монослой клеток затем отмывают, фиксируют на холоде аце-

тоном или смесью формалина с метанолом и исследуют в РИФ. Если животное было инфицировано вирусом бешенства, то в монослое культуры клеток выявля-

ются цитоплазматические включения антигена вируса бешенства.

Выделение вируса в культуре нейробластомы по крайней мере столь же эф-

фективно в отношении выявления небольших количеств вируса бешенства, как и заражение мышей. Кроме того, при использовании этой культуры снижается вре-

мя, требующееся для постановки диагноза, с 10-15 до 2 дней (антиген вируса бе-

шенства можно выявить через 2 дня). Чувствительность метода сравнима с ме-

тодом изоляции вируса на мышах, устраняется необходимость в эксперименталь-

ных животных и значительно уменьшается стоимость исследований.

Вирус бешенства способен размножается и в клетках ВНК-21 и Vero, в пер-

вичных клетках куриных эмбрионов или почек хомяка. Адсорбция вируса и вне-

дрение его в клетку происходят в течение 7 часов. Через 24–48 часов внутри клет-

ки образуются новые вирусные частицы, через 72 часов происходит почкование их из клеточной оболочки в межклеточное пространство.

Выявление телец Бабеша-Негри

Выявление телец Бабеша-Негри. На предметных стеклах делают тонкие маз-

ки или отпечатки из всех отделов головного мозга, не менее 2 препаратов с каж-

дого отдела мозга, и окрашивают по одному из методов (по Селлерсу, Муромцеву и т. д.).

143

Для обнаружения телец-включений готовят мазки или отпечатки (посмертно или прижизненно), которые подвергают специальным методам окраски с после-

дующей микроскопией. Проводят окраску по Муромцеву (для обнаружения, те-

лец Бабеши-Негри). Мазки и отпечатки готовят из нефиксированного мозга. Ку-

сочек аммонова рога растирают до гомогенной массы и делают грубые мазки на обезжиренные стекла. Мазков должно бить не менее 4, т.к. при малом количестве телец, их можно обнаружить не в каждом мазке. Фиксируют 1-2 часа - помешают мазки или отпечатки в банку с жидко-

стью и плотно закрывают крышкой,

чтобы не было испарения. Вынимают из фиксатора, промывают дистилли-

рованной водой и погружают в рас-

твор синька Мансона на 5-10 мин.

Мазок становится сине-фиолетовым.

Рисунок 50 - Тельца Бабеша-Негри.

Не промывая, мазок переносят в рас-

твор танина дан дифференцирования, которое продолжают до тех пор, пока мазок не приобретет голубой цвет. Промывают мазок водой, обсушивают и на несколь-

ко секунд помещают в спирт. Смотрят под иммерсией без покровного стекла.

Положительным результатом считают наличие телец Бабеша-Негри - четко очерченных овальных или продолговатых гранулированных образований розово-

красного цвета, расположенных в цитоплазме клеток или вне их (рисунок 50).

Данный метод имеет диагностическое значение только при обнаружении ти-

пичных специфических включений.

Постановка биологической пробы

Наиболее эффективна по сравнению со всеми указанными выше методами.

Ее ставят при получении отрицательных результатов предыдущими методами и в сомнительных случаях.

Для биологической пробы отбирают белых мышей массой 16-20 г, нервную ткань из всех отделов головного мозга растирают в ступке со стерильным песком,

144

добавляют физиологический раствор до получения 10 % суспензии, добавляют эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота, от-

стаивают 30-40 мин и исполь-

зуют надосадочную жидкость для заражения мышат. При по-

дозрении на бактериальное за-

грязнение добавляют на 1 мл суспензии 500 ЕД пенициллина

истрептомицина и вы-

держивают 30-40 мин при ком-

жают 10-12 мышат: половину интрацеребрально по 0,03 мл, половину подкожно в область носика или в верхнюю губу по 0,1-0,2 мл (рисунок 51).

Зараженных мышат помещают в стеклянные банки (лучше аквариумы) и на-

блюдают за ними в течение 30 дней, ведя ежедневную регистрацию. Гибель мы-

шей в течение 48 ч считают неспецифической и не учитывают в оценке результа-

тов. При наличии вируса бешенства в патологическом материале с 7-10 дня после заражения у мышей наблюдают следующие симптомы: взъерошенность шерсти,

своеобразную горбатость спины, нарушение координации движений, паралич задних, затем передних конечностей и гибель. У павших мышей головной мозг исследуют в РИФ на обнаружение телец Бабеша-Негри и ставят РДП.

Биопробу на бешенство считают положительной, если в препаратах из мозга зараженных мышат обнаруживают тельца Бабеша-Негри или выявляют антиген методами РИФ или РДП. Отрицательный диагноз - отсутствие гибели мышат в течение 30 дней.

Преимущество данного подхода состоит в возможности определения малых количеств вируса бешенства в материале. Недостаток - необходимость много-

145

дневного (7–18 суток) ожидания между инокуляцией и проявлением первых при-

знаков заболевания.

Рекомендуют для ранней диагностики методом биологической пробы (осо-

бенно это важно, когда исследуемое животное покусало человека) использовать для заражения не 10-12 мышей, а 20-30 мышей-сосунков, и начиная с 3 дня после заражения ежедневно забивать по 1- 2 мышонка для исследования их головного мозга в РИФ (у мышей, забитых через 3 дня, уже выявляется антиген вируса в мозге, который можно выявить методом РИФ). Это позволяет (в положитель-

ных случаях) сократить срок исследования на несколько дней.

Такой метод выделения вируса практикуется в качестве подтверждающего диагностического теста при отрицательных результатах по выявлению антигена и телец Бабеша–Негри и в случае укуса человека подозрительным на бешенство животным. Он обеспечивает надлежащую чувствительность и специфичность, т.

е. расценивается на уровне диагностической значимости метода прямой имму-

нофлуоресценции. Кроме того, этот метод является основным для идентификации вариантов вируса и перспективен для разработки диагностических реагентов.

В лабораторной практике ставят метод так называемой специфической био-

логической пробы. Сущность его в том, что мыши заболевают при заражении моз-

говой тканью больных бешенством животных и не заболевают, если эту ткань предварительно обработать антирабической сывороткой (10 мин при 37 °С).

Методы прижизненной диагностики бешенства

Важным аспектом диагностики заболевания является прижизненная диагно-

стика, огромное значение для принятия решения о применении средств иммуно-

профилактики имеет постановка диагноза как можно в более ранние сроки.

Выбор методов прижизненной диагностики в значительной мере зависит от стадии болезни: метод, основанный на выявлении антигенов, как правило, обла-

дает высокой чувствительностью в конце инкубационного периода, в течение первых нескольких дней заболевания, в то время как вируснейтрализующие анти-

146

тела обычно появляются в спинномозговой жидкости и сыворотке крови после 7-

10 дней от начала болезни.

Некоторые исследователи рекомендуют проводить прижизненную диагно-

стику бешенства методом РИФ отпечатков роговицы или биоптатах кожи боль-

ных бешенством животных, но эффективность этого метода невысока.

Кроме этого, вирус может быть выделен из некоторых тканей и жидкостей организма, особенно из слюны и спинно-мозговой жидкости. Однако, если поло-

жительный результат исследования свидетельствует о заболевании бешенством,

то отрицательный результат не исключает возможности заражения.

Дифференциация бешенства от других заболеваний

-у собак: от болезни Ауески, листериоза, ботулизма, нервной формы чумы плотоядных;

-у лошадей от инфекционного энцефаломиелита лошадей;

-у крупного рогатого скота: от злокачественной катаральной горячки.

Также необходимо исключить отравления, колики, тяжелые формы кетоза,

при наличии инородных тел в ротовой полости и глоте – закупорку пищевода.

Обычно в лаборатории проводят исследование в следующей пос-

ледовательности: из головного мозга делают мазки-отпечатки для РИФ и обнару-

жения телец Бабеша-Негри, ставят РДП, при получении отрицательных результа-

тов делают биопробу.

При высококвалифицированном выполнении РИФ получают 99-100 % сов-

падения с биологической пробой, в РДП - 45 – 70 %. Тельца Бабеша-Негри выяв-

ляют в 95 % случаев у павших от бешенства животных, у животных убитых в на-

чале болезни тельца не выявляются.

Результативность методов диагностики бешенства может варьировать в зави-

симости от ряда факторов (стадии болезни, сроков забора материала, качества по-

лученных проб, условий их хранения, опытности персонала, качества реактивов и др.). Если положительный результат подтверждает бешенство, то отрицательный

147

не всегда свидетельствует об отсутствии болезни. Поэтому при бешенстве экспер-

ты ВОЗ рекомендуют использовать несколько тестов, особенно МФА в сочетании с биопробой на новорожденных (2–3 дневных) белых мышах.

Меры личной профилактики при работе с вирусом бешенства

Все работы с материалом, предположительно содержащим вирус бешенства,

равно как и с животными, подозрительными на бешенство, должны проводиться с соблюдением мер личной безопасности. Ветеринарные врачи должны быть обяза-

тельно вакцинированы против вируса бешенства и должны работать в спецодеж-

де: в халатах, перчатках, масках.

По окончанию работы боксы обязательно дезинфицируют.

Флаконы, ампулы и инструменты, а также оставшиеся материалы, содержа-

щие вирус бешенства, и всю посуду после работы обеззараживают автоклавиро-

ванием в течение 1 часов при 1,5 атм (режим «убивки»).

Средства индивидуальной защиты обеззараживают кипячением или автокла-

вированием. Рабочую поверхность стола и руки обеззараживают дезраствором

(0,5 % раствор хлорамина).

Некоторые сведения о вирусе бешенства

К вирусу бешенства восприимчивы домашние, дикие животные и человек.

Болезнь неизлечима. Особая опасность бешенства состоит в том, что до на-

стоящего времени не найдено эффективных средств лечения уже развившегося болезнетворного процесса. Поэтому, больных бешенством животных, лечить запрещено, узаконено их немедленное уничтожение.

Болезнь известна с глубокой древности, так в кодексе законов Вавилона

(2300 лет до н.э.) есть упоминание о гидрофобии; в произведениях древних гре-

ков; рисунки, изображающие бешеных собак. Аристотель (IV век до н.э.) в своих трудах высказывает мысль о передаче болезни животным или человеку через уку-

сы «взбесившихся» собак. Даже название Rabies, Lyssa (греч.) отражают главный клинический признак болезни и переводятся, как неистовство, безумная ярость.

148

Луи Пастер (рисунок 52) установил вирусную этиологию бешенства в 1881-

1889г.г. В 1890 г. ученики Пастера Ру и Нокар установили, что слюна больных животных становится заразной за 3-8 дней до клинического проявления болезни.

В связи с этим подозрительных по заболеванию собак и кошек следует в течение

10 дней содержать в условиях строгой изоляции под контролем. Если у них за это время не появится признаков бешенства, то, следовательно, их слюна в момент укуса не содержала вирус. Пастер создал вакцину путем последовательных серий заражений интрацеребрально кроликов. Полученный штамм был назван "фикси-

рованным" (Virus fixs) и приобрел постоянную вирулентность при интрацереб-

ральном заражении кроликов, утратив ее при иных способах инфицирования.

Фикс вирус настолько адаптировался к ЦНС, что уже не вызывал болезнь у жи-

вотных если его вводили им подкожно в обычных летальных дозах. Так была по-

лучена возможность вводить V.f. для создания иммунитета у животных и лю-

дей.

6 июля 1885 года - знаменательный день в истории медицины. К Пастеру обратилась мать 9-летнего мальчика из Эльзаса. За 2 дня до этого ребенок был искусан бешеной соба-

кой. Пастер верил в действенность своей вакцины, мальчик же все равно был обречен на смерть. Пастер решил применить свой метод. Два профессора констатировали, что у ребенка 14 рваных ран, нанесенных живот-

ным, обработка их ничего бы не дала, и оба профессора единогласно признали, что ребе-

нок обречен на смерть, и прививки Пастера не могут ухудшить положения, поэтому и не Рисунок 52 - Луи Пастер.

возражали против них. 20 дней после прививок были очень тяжелыми в жизни Пастера, его мучила мысль, что мальчик может погибнуть от смертельных доз вируса, которые ему ввели в ходе прививок. Но состояние мальчика осталось хо-

149

рошим и после дня предполагаемого кризиса отпали сомнения, что появятся при-

знаки болезни. Ребенок бешенством не заболел, т.к. при длительном инкубацион-

ном периоде при бешенстве фикс вирус создает иммунитет.

В 1886 году в Одессе была открыта II пастеровская станция.

Введение в практику пастеровских прививок привело к снижению смертно-

сти от бешенства более чем в 10 раз.

Важным моментом при диагностике явилось открытие в ганглиозных клет-

ках головного мозга и в аммоновых рогах (протоплазме нейронов), погибших от бешенства животных, включений Бабешем (румын) в 1887 г., а позже их подроб-

но описал итальянец Негри (1903). С 1950 г. их стали называть тельцами Бабеша-

Негри.

Инкубационный период варьирует от нескольких дней до года и более, чаще всего – 3-6 недель. Буйная форма характеризуется тремя стадиями.

1. Продормальная (меланхолическая) стадия – изменение в поведении жи-

вотного. Животное становится либо ласковым, либо, наоборот, настороженным,

неподдающимся командам. Появляется возбудимость, сильный зуд на месте уку-

са. Аппетит понижен или извращен, галлюцинации.

2. Возбуждение (маниакальная стадия) – через 2-3 дня после появления пер-

вых признаков болезни. Усиление беспокойства и резкое возбуждение животного

(вплоть до неистовства). Животное кидается на людей, животных, стремиться со-

рваться с привязи и убежать, набрасывается на различные предметы, грызет из и даже собственное тело. Возникают припадки, параличи отдельных групп мышц конечностей, глотки и гортани. Развивается косоглазие, нижняя челюсть отвисает,

язык высунут, слюнотечение. Лай хриплый, заглушенный. Стадия возбуждения длится 2-3 дня.

3. Паралитическая (депрессивная) стадия – животное истощено и теряет под-

вижность задней части тела. Походка шаткая, развивается паралич задних конеч-

ностей, прямой кишки и мочевого пузыря. Затем паралич передних конечностей и других частей тела. Животное погибает. Стадия длится 2-4 дня.

150