2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)

стве вируссодержащего материала. Одновременно с той же цепью берут регио-

нарные лимфатические узлы.

Каждую пробу материала, разделив на две части, помещают отдельно в две стерильные пробирки, закрытые резиновыми пробками. Ткань одной пробирки предназначается для вирусологических исследований, поэтому ее сразу же зали-

вают соответствующим фиксатором. В тех случаях, когда в комплексе диагности-

ческих исследований на определенную инфекцию предполагаются микроскопи-

ческие методы обнаружения вируса (световая, люминесцентная микроскопия), из вируссодержащих органов делают мазки или отпечатки.

Учитывая, что специфические для вируса изменения могут быть локализова-

ны в различных отделах органа (в мозге при бешенстве), отпечатки готовят сле-

дующим образом: мозг мелкого животного из вскрытой черепной полости, не по-

вреждая структуры, переносят на лист (10x10см) фильтровальной бумаги, где он достаточно прочно фиксируется. Браншами глазных ножниц отрезают по верти-

кальной плоскости его небольшой кусочек и кладут на бумагу рядом. Затем отре-

зают следующий слой мозга и также кладут рядом и т.д. Взяв в левую руку лист бумаги с фиксированными на нем кусочками мозга, правой рукой прикладывают сверху к каждому поочередно предметное обезжиренное стекло, получая от-

печатки.

Перечень контрольных вопросов:

1.Виды лабораторных животных.

2.Наиболее часто применяемые на практике методы экспериментального заражения животных.

3.Признаки размножения вируса в организме лабораторных животных.

4.«Слепой» пассаж.

5.Лапинизированнвые вакцины.

6.Животные-гнотобиоты.

7.Латентные инфекции.

8.Тропизм вируса.

9.Фиксация лабораторных животных.

41

10. Отбор патологического материала при вскрытии лабораторного живот-

ного.

Тема 1.4. Куриные эмбрионы и их использование в вирусологии

Цель: изучить способы применения куриных эмбрионов в вирусологической

практике.

Содержание:

цели использования куриных эмбрионов в вирусологии;

строение куриного эмбриона;

требования, предъявляемые к куриным эмбрионам;

уход за животными и их содержание;

подготовка куриных эмбрионов к заражению;

методы экспериментального заражения куриных эмбрионов;

признаки размножения вируса в организме куриного эмбриона;

вскрытие куриного эмбриона и получение вируссодержащего материала.

Куриные эмбрионы имеют ряд преимуществ перед лабораторными живот-

ными: скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрион от бакте-

риального заражения со стороны внешней среды; высокая чувствительность эм-

брионов к широкому спектру вирусов; легкодоступность, экономичность; не тре-

буют ухода и кормления.

Требования, предъявляемые к куриным эмбрионам при заражении:

1.Куриные эмбрионы должны быть получены из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням,

2.Скорлупа яиц должна быть непигментированной, чистой (мыть нельзя).

3.Возраст эмбрионов должен соответствовать избранному методу заражения.

Размножение вирусов происходит во всех структурах эмбриона. Заражение в

ту или другую часть эмбриона проводится в период ее максимального развития,

когда количество чувствительных клеток будет наибольшим.

В процессе инкубации меняются размеры зародышевых структур (так, жел-

точный мешок как резервуар питательных веществ имеет наибольший объем в

42

начале инкубации, а затем уменьшается), поэтому заражают в желточный мешок с

5-го по 7-й день инкубации. Для заражения в амниотическую полость (буферная среда) используют куриные эмбрионы в возрасте 6-10 дней. Аллантоисная по-

лость (служит для сбора продуктов обмена, в ней скапливаются мочекислые соли,

фосфорные и азотистые соединения, приобретает кислую реакцию) максималь-

ных размеров достигает на 9-12-й день, поэтому заражение проводят на 9-11-й

день. ХАО богата кровеносными сосудами, которые, тесно прилегая к внутренней поверхности скорлупы, насыщаются кислородом и снабжают им зародыш, выпол-

няя функцию органа дыхания эмбриона. Максимального развития ХАО достигает на 11-13-й день. Заражение на ХАО проводят на 10-12-й день.

Подготовка куриных эмбрионов к заражению (рисунок 8). Куриные эмбрио-

ны доставляют из инкубатория, не допуская их охлаждения в пути. В лаборатории куриные эмбрионы инкубируют в термостате при температуре 37 °С и влажности

60-70 % (в термостате устанавливаются сосуды с водой). Куриные эмбрионы раз-

мещают воздушной камерой вверх в специальных штативах и выдерживают сутки до заражения для адаптации к новым условиям.

Подготовка эмбрионов к заражению включает: овоскопирование, дезинфек-

цию скорлупы и подготовку рабочего места. Овоскопирование представляет собой просмотр яиц против достаточно яркого источника света (овоскоп), в результате чего на неосвещенной стороне скорлупы образуются тени от внутренних струк-

тур. Овоскопирование проводят в затемненном помещении. При этом на скорлу-

пе графитным карандашом отмечают границу воздушной камеры, место располо-

жения зародыша и участок бессосудистой зоны размером 0,5x0,5 см. Эти отметки служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала.

При овоскопировании также определяют, жив зародыш или погиб.

43

Рисунок 8 - Заражение куриных эмбрионов.

Зародышей, проявляющих активные движения при хорошей кровенаполнен-

ности сосудов ХАО, считают живыми.

Куриные эмбрионы заражают в асептических условиях (лучше в боксе). В

предбокснике скорлупу эмбрионов обрабатывают йодированным спиртом, затем уже в боксе повторно протирают, а иногда еще и фламбируют. Куриные эмбрио-

ны фиксируют в специальных подставках, установленных в эмалированной кюве-

те на 3-4-слойной марлевой салфетке, смоченной дезинфицирующим раствором.

44

Рисунок 9 - Методы экспериментального заражения куриных эмбрионов.

Методы экспериментального заражения эмбрионов (рисунок 9). Из 6-ти ме-

тодов чаще применяют заражение в аллантоисную полость и на ХАО, реже - в

амниотическую полость и в желточный мешочек и совсем редко - в тело зароды-

ша и в кровеносные сосуды ХАО. Выбор метода определяется тропизмом вируса,

а также целью заражения. При любом методе заражения вводят 0,1-0,2 мл инфек-

ционного материала.

Заражение в аллантоисную полость. Используют для размножения вирусов гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей, везикулярного стоматита и др.

45

Первый вариант. Куриные эмбрионы фиксируют вертикально тупым концом вверх. В скорлупе на стороне зародыша, а иногда с противоположной зародышу стороны на 5-6 мм выше границы воздушной камеры делают отверстие диамет-

ром около 1 мм. Иглу вводят параллельно продольной оси на глубину 10-12 мм.

После инъекции вируссодержащего материала иглу извлекают, а отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного стерильного парафина.

Второй вариант. Сделанное в скорлупе над воздушной камерой отверстие используют лишь для выхода части воздуха. Отверстие же для самого заражения делают на участке бессосудистой зоны ХАО со стороны зародыша. Иглу вводят на глубину не более 2-3 мм. Инъецируют инфицирующую жидкость в объеме 0,1-

0,2 мл и закрывают отверстие парафином.

Заражение на ХАО. Используют для культивирования вирусов оспы, инфек-

ционного ларинготрахеита птиц, чумы плотоядных, болезни Ауески, катаральной лихорадки овец и др. Такое заражение может быть выполнено через естественную или искусственную воздушную камеру.

Для заражения через естественную воздушную камеру Эмбрионы помещают в штатив вертикально тупым концом вверх и в скорлупе против центра воздуш-

ной камеры вырезают круглое окно диаметром 15-20 мм. Через это окно пинце-

том снимают подскорлупную оболочку. На обнажившийся участок ХАО наносят

0,2 мм вируссодержащей суспензии, отверстие закрывают лейкопластырем или реже покровным стеклом, укрепив его расплавленным парафином.

Заражение через искусственную воздушную камеру применяют чаще первого,

т.к. оно обеспечивает контакт вируссодержащего материала с большей поверхно-

стью ХАО и ведет к образованию большего количества вируса. Эмбрионы поме-

щают в штатив горизонтально зародышем вверх. В скорлупе делают два отвер-

стия: одно небольшое над центром воздушной камеры (предназначено для отса-

сывания из нее воздуха), а другое диаметром 0,2-0,5 см сбоку, со стороны заро-

дыша. Сложность метода в том, что, делая второе отверстие, необходимо осто-

рожно снять вначале кусочек скорлупы, затем скользящим движением, не повре-

ждая ХАО, сдвинуть подскорлупную оболочку в сторону так, чтобы через обра-

46

зовавшийся дефект мог пройти воздух. После этого резиновой грушей через пер-

вое отверстие отсасывают воздух из естественной воздушной камеры. В результа-

те через боковое отверстие наружный воздух устремляется внутрь, образуя искус-

ственную воздушную камеру, дном которой является ХАО.

Через боковое отверстие на поверхность ХАО наносят инфекционную жид-

кость и отверстие закрывают кусочком лейкопластыря. Закрывать первое отвер-

стие нет необходимости, т.к. внутренний листок подскорлупной оболочки при этом методе заражения не нарушается и продолжает выполнять роль барьера для микрофлоры окружающей среды.

Дальнейшую инкубацию эмбрионов, зараженных этим методом, проводят в горизонтальном положении боковым отверстием вверх.

Заражение в желточный мешок. Используют для размножения хламидий,

вирусов болезни Марека, ринопневмонии лошадей, катаральной лихорадки овец и др. Заражают КЭ 5-7-дневного, а иногда и 2-3-дневного возраста (вирус лихорад-

ки долины РИФ).

Первый вариант. Эмбрионы помещают в штатив в вертикальном положении.

Делают отверстие в скорлупе над центром воздушной камеры и вводят иглу на глубину 3,5-4 см под углом 45 ° к вертикальной оси в направлении, противопо-

ложном месту нахождения зародыша.

Второй вариант. Иногда аналогичный путь заражения осуществляется на горизонтально укрепленном в штативе эмбрионе; при этом зародыш находится внизу, а желток - над ним. Отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленно-

го парафина.

Заражение в амниотическую полость. Используют эмбрионы 6-10-дневного возраста, для вирусов гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей и др.

Закрытый способ. Заражение проводят в затемненном боксе. Яйцо помеща-

ют на овоскопе в горизонтальном положении зародышем вверх. Через отверстие в скорлупе над воздушной камерой вводят иглу с затупленным концом по направ-

47

лению к зародышу. Доказательством того, что игла проникла в амнион, служит движение тела зародыша в направлении передвижения.

Открытый способ. Скорлупу над воздушной камерой срезают так, чтобы образовалось окно диаметром 1,5-2,5 см. Через него пинцетом под контролем гла-

за снимают подскорлупную оболочку. Затем анатомический (14 см) пинцет с сомкнутыми браншами ведут, продавливая ХАО по направлению к зародышу.

Когда пинцет достигнет его, бранши размыкают, захватывают амниотическую оболочку вместе с ХАО и подтягивают к окну. Удерживая левой рукой пинцет с фиксированной в нем оболочкой амниона, вводят вируссодержащий материал.

Далее все оболочки опускают, окно закрывают лейкопластырем и эмбрион инку-

бируют в кортикальном положении.

Заражение в тело зародыша. Для заражения используют эмбрионы 7-12-

дневного возраста.

Первый вариант. Заражают так же, как в амнион закрытым способом, с той лишь разницей, что берут острую иглу и на овоскопе показателем попадания иглы в тело считают подчинение зародыша движениям иглы.

Второй вариант. Заражают так же, как в амнион открытым способом: через окно в скорлупе подтягивают пинцетом тело зародыша. Материал вводят в голов-

ной мозг или определенные участки тела. При таких методах заражения бывает значительный процент неспецифической гибели эмбрионов.

Заражение в кровеносные сосуды ХАО. При овоскопировании 11-13-

дневных эмбрионов отмечают крупный кровеносный сосуд. По его ходу удаляют участок скорлупы, наносят 1-2 капли спирта, что делает на некоторое время под-

скорлупную оболочку прозрачной. Под контролем глаза на овоскопе иглу вводят в сосуд, что подтверждается его подвижностью при небольших боковых дви-

жениях иглы. Обнаженный участок подскорлупной оболочки закрывают кусоч-

ком лейкопластыря.

Можно материал в сосуды ввести и несколько отличающимся способом: сре-

зают скорлупу над воздушной камерой, подскорлупную оболочку смачивают

48

спиртом и в ставшие видными сосуды ХАО вводят материал. Отверстие закрыва-

ют кусочком стерильного лейкопластыря.

Перед дальнейшей инкубацией на скорлупе зараженных любым методом эм-

брионоов простым (графитным) карандашом пишут, чем заражен КЭ и когда, а

если нужно, то и другие сведения. Зараженные эмбрионы помещают в термостат для дальнейшей инкубации, в процессе которой происходят репродукция внесен-

ных вирусов и их накопление в соответствующих структурах. Температура инку-

бации варьирует от 33 до 38 °С в зависимости от свойств вируса, которым прове-

дено заражение. За КЭ ведут постоянное наблюдение, просматривают на овоско-

пе, отбирая павшие.

Гибель эмбрионов в первые 24 ч после заражения чаще всего обусловлена размножением грибов, бактериальной микрофлоры, внесенных в эмбрион вместе с инокулятом, или травмированием при заражении. Эта гибель считается неспе-

цифической. В более поздние сроки эмбрионы гибнут в результате размножения вируса. Обнаружив погибшие эмбрионы, их сразу же переносят в холодильник с температурой 4 °С. Такие условия способствуют сохранению активности нако-

пившегося в эмбрионе вируса и уплотнению тканей и запустению сосудов, что значительно облегчает последующее вскрытие.

Куриные эмбрионы инкубируют до момента максимального накопления ви-

руса. Для каждого вируса и даже штамма этот срок является определенным и варьирует в пределах от 2 до 7-8 сут. Так, для вируса ньюкаслской болезни штам-

ма Н он составляет 2-3 дня, для того же вируса штамма В - 5 дней. Затем все эм-

брионы умерщвляют охлаждением при 4°С в течение не менее 3-4 ч и вскрывают.

Признаки размножения вируса в КЭ. Показателем заражения эмбриона ви-

русом может служить его гибель в характерные для вируса сроки. Другой признак

- патологоанатомические изменения, появляющиеся в его различных структурах.

Так, ХАО может быть отечной, иметь кровоизлияния, узелки (оспины) - вирусы оспы птиц, инфекционного ларинготрахеита птиц, болезни Ауески и т.д. Причем диаметр оспин отличается при размножении разных вирусов. Зародыш может от-

ставать в росте и развитии. Его тело может быть обезвожено или мумифицирова-

49

но, шея перекручена. Названные признаки характерны для инфекционного брон-

хита кур. Кожа зародыша может быть гиперемирована, с кровоизлияниями. На-

бухшая желто-зеленого или темно-зеленого цвета печень - признак размножения вируса гепатита утят.

РГА. Явление гемагглютинации представляет собой соединение эритроцитов в хлопья при добавлении к ним суспензии гемагглютинирующего вируса. Гемагг-

лютинирующими свойствами обладают те вирусы, вирионы которых имеют на поверхности рецепторы, способ-

ные взаимодействовать с рецеп-

торами оболочек эритроцитов.

Такие вирионы адсорбируются на поверхности эритроцитов.

Адсорбция одного вириона од- Рисунок 10 - Учет реакции гемагглютинации.

новременно на двух эритроцитах ведет к тому, что эритроциты оказываются соединенными между собой, а адсор-

бировавшийся вирион играет роль мостика между ними. Образованием таких мос-

мостиков между многими эритроцитами и объясняется склеивание эритроцитов в хлопья (рисунок 10).

Образование хлопьев, видимых невооруженным глазом, можно наблюдать при смешивании капли суспензии вируса с каплей отмытых эритроцитов на пло-

ской поверхности (стекла, керамики и др.). При смешивании суспензии эритроци-

тов и вируса в пробирке хлопья эритроцитов оседают ровным слоем на дно в форме так называемого зонтика.

РГA используют для обнаружения и титрования вирусов. Хлопья эритроци-

тов появляются через 5-10 мин после смешивания капли вируссодержащей жид-

кости и капли взвеси эритроцитов. (+)РГА не только указывает на присутствие вируса, но и выявляет его гемагглютинирующую активность с определенным ви-

дом эритроцитов, что может служить вспомогательным диагностическим призна-

ком.

50