тальные оставляют на неизменном уровне. Этот метод является надежным, но довольно длительным.

При использовании математических методов планирования эксперимента можно значительно быстрее найти и научно обосновать оптимальный состав питательной среды. Математическое планирование экспериментов принимают при изучении новых продуцентов фармацевтических препаратов.

Существует понятие «минимальных» сред, содержащих лишь источники питания, необходимые для роста и «богатые» среды, которые содержат допол-

нительные вещества в форме аминокислот, витаминов (т.е. факторы роста).

Обогащение сред для культивирования приводит к увеличению скорости роста и изменению ферментного состава биомассы.

Если основной целью биотехнологического процесса является синтез ле-

карственного препарата, то к среде добавляют определенные вещества – пред-

шественники или его близкие аналоги, которые включаются в молекулу про-

дукта. Так, в производстве пенициллина и витамина В12 в качестве предшест-

венников используют фенилуксусную кислоту.

Различают питательные среды общего назначения (универсальные) и спе-

циальные питательные среды. Питательные среды общего назначения пригод-

ны для выращивания многих видов микроорганизмов и применяются в качест-

ве основы для приготовления специальных питательных сред. К ним относят-

ся, например, мясо-пептонный бульон, агар, бульон Хоттингера, агар Хоттин-

гера и др. Специальные питательные среды предназначены для избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, изучения их свойств и хранения.

Приготовление и стерилизация питательных сред

Одним из важных этапов микробного биосинтеза является приготовление питательных сред. Отделение приготовления питательной среды на современ-

ном биотехнологическом производстве – это цех, оборудованный емкостями для хранения твердых и жидких веществ, средствами их транспортировки и

201

аппаратами с перемешивающими устройствами для приготовления растворов,

суспензий или эмульсий.

Для приготовления производственной питательной среды предварительно растворяют сахара и соли, тщательно суспендируют такие нерастворимые компоненты, как соевая мука и мел. Крахмалосодержащее сырье предвари-

тельно клейстеризуют. Для ускорения эти процессы проводят в небольших ап-

паратах с мешалками (реакторах), а затем растворы смешивают в смесителе-

реакторе с плоским дном, снабженным барботажным устройством для ввода пара. Концентрат среды, составляющий около одной трети необходимого об ъ-

ема, для окончательного растворения и суспендирования нагревают острым паром до 70-80 ºС. При этой температуре не происходит разложения термола-

бильных компонентов среды. Приготовление более концентрированных сред дает возможность использования смесителей меньшей вместимости.

Необходимое условие успешной стерилизации питательной среды – тща-

тельная гомогенизация ее твердых компонентов. При температуре стерилиза-

ции крупные частицы медленно прогреваются, и в них может сохраняться п о-

стоянная микрофлора, способная инфицировать культуральную жидкость.

Для приготовления питательных сред в биотехнологическом производстве используют мелассу (побочный продукт сахарных заводов), ацетоно-

бутиловую барду (отходы производства ацетона и бутанола), сыворотки (по-

бочный продукт молочной промышленности), гидролизаты древесины, суль-

фитный щелок (отходы целлюлозно-бумажной промышленности). Ацетоно-

бутиловая барда содержит около 1% углеводов, используется для получения витамина В12 микробиологическим путем.

Щепа, опилки, сельскохозяйственные отходы, малоразложившийся торф и их гидролизаты используются в производстве кормовых дрожжей, этанола.

Они содержат 2,5-8,0% моносахаридов (после гидролиза), кукурузная мука –

67-70%. Уксусная кислота применяется для приготовления питательных сред в производстве лизина. Метиловый спирт получают каталитическим синтезом из

202

оксидов углерода и водорода. Это источник углеродсодержащего сырья для производства микробного, кормового и пищевого белка.

Питательная среда перед подачей в ферментер должна быть обеззаражена.

На этом этапе подготовки субстрата необходимо решить две задачи: полно-

стью уничтожить всю контаминантную микрофлору, которая содержится в не-

обходимом для культивирования объеме жидкости, и сохранить биологиче-

скую полноценность питательной среды.

Существуют следующие методы стерилизации оборудования, питательных сред и воздуха: термический, химический, фильтрационный, радиационный.

Термический метод чаще всего применяется для стерилизации оборудования и питательных сред и может осуществляться как нагревание объекта до того, по-

ка не погибнет вся микропопуляция.

Жидкую питательную среду после загрузки в ферментер нагревают до оп-

ределенной температуры путем подачи пара во внутренний объем ферментера.

Этим приемом достигается стерилизация труб и арматуры.

Тепловая стерилизация приводит к определенным химическим изменени-

ям в составе питательной среды. Некоторые из них сводятся к разложению н е-

стойких к нагреванию соединений, что приводит к потере необходимых для питания микроорганизма веществ. В процессе стерилизации может происх о-

дить взаимодействие различных компонентов среды и образование продуктов,

ингибирующих рост микроорганизмов. большинство изменений химических ингредиентов среды возникает при температурах выше, чем температура ст е-

рилизации.

Следовательно, эффективная стерилизация в сочетании с минимальными изменениями среды может быть достигнута путем воздействия более высокой температуры, а также быстрого нагревания и охлаждения.

Если стерилизацию углеводов проводить отдельно, а затем асептически добавлять к остальной заранее простерилизованной питательной среде, то можно предотвратить реакции между углеводами и другими составными ком-

понентами среды. Те компоненты, которые в высшей степени чувствительны к

203

воздействию тепла, также могут быть простерилизованы раздельно. При этом для стерилизации может применяться ионизирующее облучение или фильтр а-

ция через специальные мембранные фильтры.

Для обеспечения контроля стерилизации используют споры тест микроор-

ганизмов Bacillus stearothermophilus штамма 1518. Если после проведения сте-

рилизации из ампулы с тест-культурой высев дает отрицательный результат,

считают, что произошло уничтожение всех микроорганизмов, контаминир о-

вавших среду.

Решая задачу по гарантированной стерильности питательной среды, сле-

дует помнить, что режим обеззараживания не должен снижать ее биологиче-

скую полноценность. Если в состав стерилизуемой фазы входят термолабиль-

ные компоненты, то следует стремиться к повышенной температуре (более 140 ºС), а также к сокращению времени обработки. Лабильность компонентов м о-

жет быть изменена за счет сдвига pH стерилизуемой среды. Например, для глюкозы оптимальными являются pH=3,0, а для сахарозы – pH=8,0.

Термический способ стерилизации применяется наиболее часто в микр о-

биологической промышленности. Однако для стерилизации твердых питатель-

ных сред применяют токи высокой частоты. Стерилизация осуществляется в течение нескольких минут, при этом физико-химические свойства компонен-

тов среды не изменяются.

Химический способ стерилизации – это применение дезинфицирующих агентов – β-пропионатов, окись этилена, окись пропилена. Основной пробле-

мой в этом случае оказывается необходимость устранения стерилизующего агента из питательной среды после гибели посторонней микрофлоры. Поэтому химические антисептики должны легко разлагаться при изменении условий после завершения стерилизации. Выбор таких соединений невелик, и пока их нельзя считать легко доступными. К числу лучших из них можно отнести пр о-

пиолактон, обладающий сильным бактерицидным действием и легко гидрол и-

зуемый в нетоксичную молочную кислоту. Химическая стерилизация пита-

204

тельных сред не нашла промышленного применения, однако используют ее в лабораторных и опытных установках.

Фильтрационный метод стерилизации применяют для воздуха и газов,

подводимых к реакторам. Из фильтров различных типов наиболее перспектив-

ны мембранные фильтры из тефлона.

Метод основан на способности полупроницаемых мембран (типа микро-

фильтрационных) пропускать жидкую фазу и задерживать клетки микроорга-

низмов.

Метод стерилизующей фильтрации является идеальным средством ст ери-

лизации термически неустойчивых жидких и газовых сред. Стерилизация ос у-

ществляется при низкой температуре и требует лишь градиента давления по разные стороны мембраны. Мембранная стерилизация имеет перспективы в развитии микробной биотехнологии. Основная трудность – наличие термо-

стойких мембран, способных выносить многократную термическую стерили-

зацию их в процессе эксплуатации. Можно утверждать, что по мере создания совершенных конструкций мембранных аппаратов для стерилизации, рассчи-

танных на длительную эксплуатацию, данный метод будет широко применять-

ся в крупнотоннажных производствах.

Подготовленное и соответствующим образом поданное в техногенную эко-

логическую нишу сырье должно быть использовано биообъектом в процессе культивирования. Этап культивирования слагается из получения посевного мате-

риала (инокулята) и из стадии биосинтеза (биотрансформации), когда в макси-

мальной степени используются возможности биообъекта для наработки целевых продуктов.

Получение посевного материала

Для получения посевного материала используют исходную музейную куль-

туру продуцента, которая поступает в заводскую лабораторию из научно-

исследовательского института или с посевной станции.

Как правило, посевной материал, содержащий молодые, растущие клетки микроорганизмов на начальной стадии спорообразования (споры, конидии) по-

205

ступает в пробирках на скошенных агаровых средах или в виде чистых культур в ампулах.

Каждая производственная культура имеет паспорт, в котором указаны проду-

цент и его коллекционный номер, серия и дата изготовления, средняя активность серии и срок годности. В паспорте представлена характеристика среды для выра-

щивания и хранения культуры. Полученный посевной материал подвергают тща-

тельному микробиологическому и биохимическому контролю, так как от его ак-

тивности и чистоты зависит дальнейший производственный цикл.

В зависимости от вида продуцента, его физиолого-биохимических способно-

стей приготовление посевного материала (до стадии производственной фермента-

ции) проходит в несколько этапов:

1.исходная культура

2.скошенная агаровая среда

3.выращивание на качалке в колбах на жидкой питательной среде (одна или две стадии)

4.посевные аппараты (одна, несколько стадий)

5.стадия производственной ферментации.

Исходную культуру при оптимальных температурах выращивают в пробирках на скошенной агаровой питательной среде. Для микроскопических грибов, акти-

номицетов продуценты культивируют до наступления оптимального спорообра-

зования (72-120 час), для бактериальных культур фаза устанавливается экспри-

ментально.

Выращенную культуру (1-5 % от объема) с поверхности скошенной агаровой среды стерильно смывают водой и переносят в колбы Эрленмейера на 750 мл,

содержащие 50-100 мл жидкой питательной среды. Засеянные колбы выращивают на качалке (120-240 об/мин) при температуре 28-30-50 °С в течение 18-36 часов,

т.е. глубинным способом, что увеличивает скорость роста культуры. Все стадии роста продуцента контролируют по морфологическим показателям микроорга-

низмов. При этом установлено, что наилучшие результаты дает культура, которая находится в стадии физиологической зрелости.

206

Готовую культуру стерильно переносят в посевной аппарат (малый инокуля-

тор) с предварительно простерилизованной питательной средой. Посевной аппа-

рат оснащен мешалкой, аэрирующим устройством, а также контрольно-

измерительной аппаратурой для регулирования рН среды, температуры и степе-

ни аэрации.

Масштабирование при получении инокулята желательно осуществлять то-

гда, когда рост популяции происходит с максимальной скоростью, т.е. в экспо-

ненциальной фазе.

Перечень контрольных вопросов:

1.Какие питательные среды используют при культивирование продуцентов.

2.Как осуществляют посев микроорганизмов.

РАЗДЕЛ 4. ЧАСТНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

Тема 4.1. Современная классификация биопрепаратов

Цель: изучить виды биопрепаратов, правила их использования и хранения.

Содержание:

средства иммунопрофилактики;

лечебные и диагностические препараты;

требования, предъявляемые к биологическим препаратам;

лиофилизация биопрепаратов;

правила использования и хранения биопрепаратов, их транспортировка.

В борьбе с инфекционными заболеваниями особое место отводят своевре-

менной диагностике, специфической профилактике и терапии.

Биологические препараты - средства биологического происхождения, приме-

няемые в профилактических, диагностических и лечебных целях. Промышлен-

ность выпускает также и стимулирующие биопрепараты: иммуностимуляторы,

кормовые антибиотики, гормоны, витамины.

Средства иммунопрофилактики. К ним относят вакцины, глобулины сыво-

ротки. Основные показатели хорошего качества всех профилактических препара-

207

тов - стерильность или чистота (отсутствие контаминантов), безвредность, допус-

тимая степень реактогенности, антигенная активность и иммуногенность, эпизо-

отическая эффективность.

Штаммы микроорганизмов, применяемые для изготовления вакцин, должны быть классифицированы, клонированы и представлять собой однородную попу-

ляцию микроорганизмов с характерными морфологическими, биохимическими и антигенными признаками.

Живые вакцины содержат культуру микроорганизмов аттенуированного штамма, сохранивших высокую иммуногенность с генетически закрепленной по-

ниженной вирулентностью. Получают методом направленного изменения свойств возбудителя под воздействием внешней среды (вакцины против сибирской язвы,

туберкулеза, бруцеллеза) или путем пассажей через организм невосприимчивых животных (вакцины против бешенства, рожи свиней). Живые вакцины наиболее перспективны для ветеринарной практики, так как иммунитет после их примене-

ния образуется, как правило, раньше и характеризуется большей напряженностью и длительностью.

Инактивированные вакцины содержат культуру микроорганизмов опреде-

ленного вида, обезвреженных действием физико-химических факторов (высокая температура, ультрафиолет, фенол, формалин) и утративших способность к ре-

продуцированию (без убого разрушения клетки микроорганизма, с сохранением иммуногенных свойств возбудителя). Инактивированные вакцины по иммуноген-

ности уступают живым, поэтому их вводят в больших дозах и многократно. Что-

бы повысить иммунологическую эффективность инактивированных вакцин, ис-

пользуют депонирующие вещества (адъюванты), которые по механизму действия на антиген делят на сорбирующие и эмульгирующие.

Анатоксины - вид вакцин, применяемых для активной профилактики токси-

коинфекций животных. Получают методом обезвреживания бактерийных экзо-

токсинов 0,3 - 0,4 % формалином с выдерживанием при 38 - 40 °С в течение трех-

четырех недель. Анатоксины стимулируют синтез антитоксинов, которые, ней-

трализуя экзотоксины возбудителя, не оказывают губительного действия на него

208

самого. Широко используют поливалентный анатоксин против клостридиозов овец - инфекционной энтеротоксемии, брадзота, некротического гепатита, злока-

чественного отека овец и дизентерии ягнят.

Вакцины нового поколения - субъединичные, генно-инженерные - созданы с помощью методов биотехнологии.

По технологии изготовления вирусные вакцины делят на тканевые культу-

ральные (лапинизированные) и эмбриональные - изготовленные из различных тканей животных, организм которых был использован в качестве среды размно-

жения возбудителя.

В зависимости от примененного инактиватора все вакцины подразделяют на феноловые, формоловые, спиртовые, гретые; от добавленного адъюванта - на квасцовые (адсорбированные на алюмокалиевых квасцах), гидроокисьалюминие-

вые и масляные.

В зависимости от количества антигенов вакцины подразделяют на монова-

лентные - содержащие один антиген одного штамма (серотипа, биотипа) возбуди-

теля данной болезни; поливалентные - содержащие антигены различных сероти-

пов (биотипов, штаммов) возбудителя данной болезни; ассоциированные - содер-

жащие антигены возбудителей нескольких заболеваний;

Аутогенные - приготовленные из штамма микроорганизма, выделенного от больного животного, и для него же предназначенные.

Кроме того, выпускают вакцины жидкие и сухие - изготовленные в основном из живых слабоустойчивых штаммов, высушенные в условиях глубокого вакуума после предварительного замораживания (лиофилизация) или другим методом.

Лечебные и диагностические препараты. К средствам специфической те-

рапии относят гипериммунные сыворотки (по механизм действия делят на анти-

токсические, антибактериальные и противовирусные), сыворотки реконвалесцен-

тов, иммуноглобулины, бактериофаги, антибиотики, пробиотики. Для диагности-

ческих целей в ветеринарии используют сыворотки, иммуноглобулины, аллерге-

ны, бактериофаги, антигены, моноклональные антитела.

209

Антибактериальные сыворотки воздействуют непосредственно на возбудите-

ля заболевания, подавляя его жизнедеятельность. Биопромышленность нашей страны выпускает сыворотки против сибирской язвы, рожи свиней, пастереллеза и др.

Антитоксические сыворотки содержат антитела (иммуноглобулины), способ-

ные специфически связывать и нейтрализовывать токсины бактериального, расти-

тельного и животного происхождения. В ветеринарии применяют антитоксиче-

ские сыворотки против анаэробной дизентерии и инфекционной энтеротоксемии овец, столбняка, ботулизма, злокачественного отека и др.

Противовирусные сыворотки высокоэффективны, особенно в начале заболе-

вания. Биопромышленность выпускает сыворотки против болезней крупного ро-

гатого скота (ринотрахеит, вирусная диарея и др.), собак (чума, гепатит, энтерит).

Лечебные, профилактические и диагностические гипериммунные сыворотки обычно получают от лошадей, иногда - от волов, свиней. После окончания гипе-

риммунизации, когда в сыворотке крови животного установлено максимальное содержание специфических антител, у животного берут кровь (чаще на 7-10-й

день после последнего введения антигена). Кровь сепарируют, чтобы получить нативную плазму (сыворотку), которую отстаивают и стабилизируют (консерви-

руют), затем концентрируют, стандартизируют, стерилизуют фильтрацией и при необходимости прогревают.

После производственного контроля каждую серию сыворотки проверяют на стерильность, безвредность, специфическую активность.

На бактериальную стерильность контролируют высевами из препарата на специальные питательные среды (МПА, МПБ с глюкозой, МППБ под маслом и агар Сабуро или среду Чапека, чтобы исключить контаминацию грибковой мик-

рофлорой).

Безвредность проверяют на лабораторных животных в соответствии с норма-

тивной документацией по изготовлению сыворотки. Животные должны оставать-

ся здоровыми, без заметной местной и общей реакции в течение 10 дней.

210