2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)

проверки на безвредность, микробную загрязненность и активность в соответст-

вии с общепринятыми методами используют для иммунизации животных и птиц.

Живые вакцины имеют ряд преимуществ перед вакцинами других типов.

Главное из них - высокая иммуногенность, т.е. создание иммунитета высокой на-

пряженности и длительности, приближающегося к постинфекционному; одно-

кратная иммунизация; возможность введения естественными путями и др. Среди недостатков живых вакцин следует отметить следующие: необходимость соблю-

дения мер предосторожности при их транспортировке; хранение при температуре

4-10 °С; поствакцинальные реакции и осложнения; реверсия вирулентности; по-

сле вакцинации бактерийными вакцинами нельзя применять антибактериальные препараты в течение 7 дней.

В настоящее время биопромышленность выпускает живые вакцины против сальмонеллеза, пастереллеза, бруцеллеза, туляремии, листериоза, рожи свиней,

сибирской язвы и др.

Живые вакцины проверяют на однородность, безвредность и активность.

Для приготовления инактивированных вакцин в качестве штамма исполь-

зуют высоковирулентные и иммуногенные штаммы микроорганизмов, выращен-

ные в жидких питательных средах в котлах-реакторах; выход бактериальной мас-

сы с плотных питательных сред незначительный. По истечении срока куль-

тивирования бактериальную массу собирают и инактивируют. Последователь-

ность этих операций определяется методом выращивания культур микробов. Так,

при использовании жидких питательных сред культуру возбудителя вначале инактивируют в том же реакторе, где проводилось выращивание, а затем микроб-

ную массу отделяют от жидкой фракции центрифугированием. Если применяют плотные питательные среды, то выросшую на них культуру смывают физиологи-

ческим раствором в стерильные бутыли, в которых ее инактивируют.

Для инактивации микроорганизмов сочетают различные физические факторы

(нагревание) и химические вещества (формалин, фенол и др.), в основном форма-

лин, который необходимо добавлять в небольшом количестве (0,2 - 0,5 % и вы-

221

держивать при 37 °С в течение нескольких недель), т.к. в более высокой дозе он отрицательно действует на антигенную структуру микроорганизмов.

Стандартизацию инактивированной взвеси культуры микроорганизмов про-

водят путем сравнения с эталонами различной мутности, фотометрически подог-

нанными к мутности взвеси бактерий определенной концентрации. Приготовлен-

ную взвесь культуры проверяют на стерильность, безвредность и активность.

Для повышения эффективности инактивированных вакцин применяют депо-

нирующие средства, на которых микробные тела адсорбируются (алюминиевые квасцы, гидроксид алюминия) или их эмульгируют в минеральных маслах. До-

бавление депонирующих веществ к инактивированным культурам необходимо для создания «депо» на месте введения препарата, что способствует длительному воздействию микробного антигена на организм животного и обусловливает более высокий уровень образования антител.

Все инактивированные препараты должны быть стерильными. Для контроля на стерильность используют различные питательные среды, которые обеспечива-

ют надежное выявление аэробных и анаэробных бактерий, а также грибов и дрожжей. При выявлении бактерий приготовленные препараты уничтожают.

Важнейшим элементом контроля на безвредность является проверка вакцины на лабораторных животных, а также тех, для которых она предназначается.

Обычно для этого используют от трех до пяти животных на каждую серию изго-

товленной партии; одновременно с этим проводят проверку на лабораторных жи-

вотных.

Вакцина является безвредной, если у привитых животных она не вызывает никаких патологических симптомов и ухудшения их общего состояния. Одним из наиболее важных свойств вакцины является ее иммуногенность. Иммуногенность препаратов определяют следующим образом: животных, обладающих чувстви-

тельностью к микробам, из которых приготовлены вакцины, иммунизируют эти-

ми препаратами. Через определенные промежутки времени (14-21 сут.) иммуни-

зированным и контрольным животным вводят установленную дозу культуры мик-

роба (LD 50, или смертельная доза), затем наблюдают за ними в течение опреде-

222

ленного периода времени (сроки зависят от особенностей возбудителя). При забо-

левании (или гибели) контрольных животных иммунизированные животные должны остаться живыми и здоровыми.

Химические вакцины применяют для профилактики инфекционных болез-

ней. Они представляют собой антигены и антигенные комплексы, извлеченные из микробных культур и в той или иной степени очищенные от балластных иммуни-

зирующих веществ. В отдельных случаях извлеченные антигены являются в ос-

новном бактериальными эндотоксинами, полученными в результате обработки культур различными способами. Другие представляют собой «протективные ан-

тигены», продуцируемые некоторыми микробами в процессе жизнедеятельности в организме животных или в специальных питательных средах при соответст-

вующих режимах культивирования (например, протективный антиген сибиреяз-

венных бацилл).

Анатоксин (от греч. ana - обратно и toxikon - яд) токсин, утративший свою токсичность под действием химических или физических факторов, но сохранив-

ший антигенные и иммуногенные свойства.

Специфическая активная профилактика болезней, вызываемых токсинообра-

зующими микроорганизмами, основана на применении биопрепаратов типа ана-

токсинов, изготовляемых путем специфической обработки биомассы и обезвре-

живания экзотоксинов. Анатоксины - аналоги инактивированных вакцин препара-

ты обезвреженного токсина, очищенного от балластных веществ, сконцентриро-

ванного и адсорбированного (чаще на алюмокалиевых квасцах). Введение в ана-

токсин адсорбента имеет цель повысить его иммуногенные свойства. Основной метод перевода экзотоксина в состояние анатоксина был удачно разработан фран-

цузским иммунологом Г. Рамоном в 1923 г., который установил, что прибавление к токсину формалина в небольших количествах и выдерживание при 37 °С в тече-

ние месяца лишает его токсичности с сохранением иммунизирующей активности.

Примером служит столбнячный анатоксин.

Общий принцип создания генноинженерных вакцин состоит в том, что ген или гены, кодирующие протективные антигены возбудителя, против которого не-

223

обходимо создать вакцину, «встраиваются» в геном вирусов, бактерий или клеток эукариотов таким образом, чтобы не нарушалась их биологическая активность.

При этом наряду с антигенами хозяина нарабатывается и необходимый для полу-

чения вакцины протективный антиген.

В практике широко применяют убитые вакцины. В частности, концентриро-

ванную ГОА формолвакцину против ЭМКАРа КРС и овец; концентрированную поливалентную ГОА вакцину против брадзота, инфекционной энтеротоксемии,

злокачественного отека овец и дизентерии ягнят; анатоксинвакцину против ин-

фекционной энтеротоксемии овец; концентрированную ГОА формолвакцину про-

тив рожи свиней; преципитированную формолвакцину против геморрагической септицемии КРС, овец и свиней; полужидкую формолвакцину против пастерелле-

за КРС и буйволов; поливалентную вакцину против лептоспироза сельскохозяй-

ственных и промысловых животных; формолквасцовую вакцину против паратифа поросят; концентрированную формолквасцовую вакцину против паратифа телят;

концентрированную поливалентную формолквасцовую вакцину против паратифа,

пастереллеза и диплококковой септицемии телят; концентрированный квасцовый столбнячный анатоксин, поливалентную вакцину против колибактериоза и пара-

тифа телят, поросят, пушных зверей и птиц.

Поливалентные вакцины готовят из нескольких типов одного вида микроор-

ганизмов. Ассоциированные вакцины содержат антигены разных видов возбуди-

телей.

Перечень контрольных вопросов:

1.Отличие живых вакцин от аттенутированных.

2.Поливалентные и моновалентные вакцины.

Тема 4.4. Биотехнология изготовления гипериммунных сывороток и им-

муноглобулинов

Цель: изучить биотехнологию изготовления гипериммунных сывороток и

иммуноглобулинов.

224

Содержание:

гипериммунные сыворотки;

иммуноглобулины.

Изготовление лечебно-профилактических иммунных сывороток и иммуног-

лобулинов производит биологическая промышленность. В качестве продуцентов иммуносывороток используют лошадей, мулов, ослов, волов и реже другие виды животных. Гипериммунизацию осуществляют нарастающими дозами антигенов по утвержденным производственным схемам, отличающимся продолжительно-

стью иммунизации, интервалами между циклами иммунизации, дозами для каж-

дого цикла введения антигена и реакцией продуцента на антиген.

По окончании цикла иммунизации, когда в сыворотке крови продуцентов на-

ходится максимальное количество специфических антител, у животных берут кровь. Чаще это делают на 10-14 день после введения продуценту последней дозы антигена.

Из крови отделяют сыворотку общепринятыми методами и стерилизуют че-

рез бактериальные фильтры или методом тиндализации. В качестве консервантов используют 0,25-0,5 % растворы фенола, 0,01-0,03 % растворы тиомерсала (мер-

тиолята) или другие. Контроль на стерильность сыворотки проводят по общепри-

нятой методике высевами из препарата на питательные среды (МПА, МПБ с глю-

козой, МППБ и на агар Сабуро).

Безвредность каждой серии сывороточных препаратов проверяют на лабора-

торных животных, которым подкожно вводят 10 мл сыворотки. Они должны ос-

таваться здоровыми, без выраженных проявлений местной и общей реакции.

Специфическую активность сывороточных препаратов определяют с помо-

щью РН: чем меньше доза сыворотки, способная нейтрализовать действие опре-

деленной дозы инфекционного агента или токсина, тем выше ее активность.

На каждую проверенную серию сыворотки заполняют паспорт, в котором указывают основные показатели: биофабрику, изготовившую сыворотку, назва-

ние препарата, номер серии, дату изготовления, метод консервирования, титры,

сроки и способы хранения. На этикетке указывают лечебные и профилактические

225

дозы в зависимости от вида и возраста животных. Вводят сыворотку обычно внутримышечно или внутривенно.

Гипериммунные сыворотки применяют для лечебных и профилактических целей, так как они создают лишь временный пассивный иммунитет, который на-

ступает в ближайшие 2-3 ч и не превышает 2-3 недель.

В ветеринарии применяют следующие сыворотки: поливалентная антитокси-

ческая сыворотка против паратифа телят, ягнят, овец и птиц; поливалентная анти-

токсическая сыворотка против колибактериоза телят, поросят, ягнят; гипериммун-

ная сыворотка против пастереллеза КРС, буйволов, овец и свиней; сыворотка про-

тив рожи свиней; антитоксическая сыворотка против анаэробной дизентерии яг-

нят и инфекционной энтеротоксемии овец; сыворотка против диплококковой сеп-

тицемии телят, ягнят, поросят; антитоксическая противостолбнячная сыворотка.

Сыворотка реконвалесцентов - это сыворотка крови переболевших живот-

ных, содержащая специфические антитела, применяется с лечебной и профилак-

тической целями.

Сыворотку реконвалесцентов рекомендуется получать и применять живот-

ным в одном и том же хозяйстве. Кровь от животных-доноров берут непосредст-

венно в хозяйстве или во время убоя их на мясокомбинате.

Диагностические иммунные сыворотки и иммуноглобулины получают путем гипериммунизации животных соответствующим антигеном (возбудителем). В

большинстве случаев продуцентами сывороток являются лабораторные животные

(кролики, морские свинки), петухи, реже лошади. Готовые сыворотки проверяют на стерильность, активность и специфичность. Все они содержат специфические антитела к определенному антигену.

Диагностические сыворотки применяют в серологических реакциях в сле-

дующих целях:

1. для индикации возбудителя болезни в патологическом материале (сибир-

ская язва и др.);

2. при определении вида (серогруппы, серовара) возбудителей инфекции, вы-

деленных в чистой культуре (сальмонеллез, бруцеллез, листериоз и др.);

226

3. в качестве заведомо положительного контроля при постановке любой се-

рологической реакции.

Из диагностических сывороток готовят иммуноглобулины общепринятыми методами.

Иммуноглобулины. Важнейшей составной частью сыворотки крови являются белки, основная масса которых представлена альбуминами и глобулинами.

Иммуноглобулины представляют собой белки человека (животных), являю-

щиеся носителями активности антител и присутствующие в крови, цереброспи-

нальной жидкости, лимфоузлах, селезенке, слюне и других тканях. Синтезируют-

ся они в лимфоидных клетках, содержат углеводные группировки и могут рас-

сматриваться как гликопротеины. По электрофоретической подвижности имму-

ноглобулины относятся в основном к гамма-глобулинам и бета2-глобулинам. Био-

логическая роль иммуноглобулинов в организме связана с участием в процессах иммунитета. Их защитная функция обусловлена способностью специфически взаимодействовать с антигенами.

Активность антител установлена только у глобулиновой фракции сыворотки,

в которой методом электрофореза обнаружены α-, β- и γ-глобулины. При гипе-

риммунизации животных в сыворотке крови увеличиваются γ- и β-глобулиновые фракции. В настоящее время белки, синтезирующиеся в организме в ответ на ан-

тигенное раздражение и обладающие свойством антител, обозначают термином

«иммуноглобулины».

Таким образом, антитела, синтезирующиеся в организме, неоднородны. С

целью удаления неактивных, балластных белков, повышения эффективности и получения препаратов с высоким содержанием специфических антител применя-

ют методы очистки и концентрирования.

Принципы очистки сывороток основаны на выделении из них активных бел-

ковых фракций - иммуноглобулинов - и удалении балластных фракций, не яв-

ляющихся носителями антител.

227

Препараты иммуноглобулинов, содержащие γ- и β-глобулиновые фракции сыворотки крови, намного превосходят по своей профилактической и лечебной эффективности препараты, состоящие из нативной сыворотки.

В настоящее время выпускают специфические иммуноглобулины против бе-

шенства, столбняка, сибирской язвы и др.

Иммуноглобулины вводят подкожно или внутримышечно в дозах 0,5-2,0

мл/кг массы тела.

Антитоксические сыворотки - сыворотки, в состав которых входят антитела

(иммуноглобулины), способные специфически связывать и нейтрализовать ток-

сины микробного, растительного и животного происхождения. В целом же дан-

ным термином называют гипериммунные сыворотки, содержащие эти антитела.

Антитоксические сыворотки применяют для профилактики и лечения столб-

няка, ботулизма, злокачественного отека. Сыворотки вводят на ранних сроках за-

болевания. Антитоксинотерапия неэффективна, если клинические признаки бо-

лезни уже четко выражены, так как антитоксины не оказывают лечебного дейст-

вия и могут лишь предотвратить развитие интоксикации. Как и у всех иммуног-

лобулинов, их действие не превышает 2-3 недель.

Перечень контрольных вопросов:

1.Получение гипериммунных сывороток.

2.Сыворотки крови реконвалесцентов.

3.Антитоксические сыворотки.

4.Иммуноглобулины.

228

3. ФОРМА ПРОМЕЖУТОЧНОГО КОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ СТУДЕНТОВ

Результаты изучения тем лабораторных занятий учитываются при проведе-

нии промежуточной аттестации обучающегося.

229

СПИСОК РЕКОМЕНДОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Основная литература:

1. Госманов, Р. Г. Ветеринарная вирусология [Электронный ресурс]: учеб. /

Р. Г. Госманов, Н. М. Колычев, В. И. Плешакова. - СПб.: Лань, 2010. - 480 с. –

ЭБС «Лань».

2. Нетрусов, Александр Иванович. Введение в биотехнологию [Текст]: учеб-

ник для студентов вузов, обуч. по направлению "Биология" и смежным направле-

ниям / Нетрусов, Александр Иванович. - М.: Академия, 2014. - 288 с.

Дополнительная литература

1. Никульников, Владимир Семенович. Биотехнология в животноводстве

[Текст]: учебное пособие для студентов вузов, обуч. по спец. 110401 - Зоотехния /

Никульников, Владимир Семенович, Кретинин, Владимир Кириллович. - М.: Ко-

лос, 2007. - 544 с.

2.Понамарев, А.П. Электронная микроскопия некоторых вирусов животных

иусловно-патогенных микроорганизмов [Текст] / А. П. Понамарев, В. Д. Мищен-

ко. – Владимир: Фолиант, 2005. - 160 с.

3. Пономарев, А.П. Вирус ящура: структура, биологические и физиологиче-

ские свойства [Текст] / А. П. Понамарев, С. П. Узюмов, К. Н. Груздев. – Влади-

мир: Фолиант, 2006. - 250 с.

4. Прозоркина, Н. В. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии.

Учебное пособие [Текст] / Н. В. Прозоркина, Л. А. Рубашкина. – Ростов-на-Дону:

Феникс, 2002. – 416 с.

5. Троценко, Н. И. Практикум по ветеринарной вирусологии. Учебное посо-

бие, 2-е издание, переработанное и дополненное [Текст] / Н. И. Троценко, Р. В.

Белоусова,Э. А. Преображенская. - М.: Колос, 2000. – 272 с.

230