2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)

*Из последней лунки удалить 0,2 мл.

**Из последней лунки удалить 0,4 мл.

Вприведенном примере высшим разведением сыворотки, еще полностью тормозящим гемагглютинацию, является 1:32, и титр антител записывают Т = 1:32. Запомним, что титр антител в сыворотке всегда выражается наибольшим разведением сыворотки, еще дающим определенный эффект при взаимодействии

с гомологичным антигеном.

Чем ниже титр вируса, взятого в РТГА, тем меньшие концентрации антител можно обнаруживать в сыворотке (а значит, тем выше будет их титр). Титр виру-

са 4 ГАЕ - наиболее низкий, еще позволяющий получать уверенную гемагглюти-

нацию, т.к., будучи разведенным равным объемом сыворотки, он понижается в каждой лунке до 2 ГАЕ. Это значит, что при добавлении в каждую лунку 1% сус-

пензии эритроцитов в объеме, равном суммарному объему вируса и сыворотки,

количество вирионов будет необходимое для агглютинации всех 100% эритроци-

тов (1 ГАЕ вируса агглютинирует 50 % эритроцитов в 1 % суспензии).

На точность определения титра антител влияет и кратность разведения сыво-

ротки. Чем она меньше, тем точнее будет определен титр антител.

101

Следует всегда иметь в виду, что идущие в РТГА сыворотки необходимо предварительно освобождать от термостабильных неспецифических ингибиторов вирусов, обладающих способностью ингибировать гемагглютинирующие свойст-

ва вирусов. С этой целью сыворотки обрабатывают одним из следующих веществ:

углекислым газом (С02), периодатом калия (КIO4), этакридина лактатом (ривано-

лом), каолином, активированным углем, экстрактом холерного вибриона и др.

Простейшим является метод освобождения сывороток от термостабильных неспецифических ингибиторов вирусов с помощью С02. Для этого сыворотку раз-

водят дистиллированной водой 1:10 и пропускают через нее С02 (из баллона или аппарата Киппа через тонкую трубку), так чтобы газ пузырьками проходил через жидкость в течение 3-5 мин (пока сыворотка не помутнеет). Затем сыворотку цен-

трифугируют 10-20 мин при 20002500 мин-1 и собирают надосадочную жидкость

(ингибиторы уходят в осадок). Для восстановления изотонии к сыворотке добав-

ляют 8,5 % хлористый натрий в объеме, равном 0,1 объема разведенной водой сы-

воротки. При использовании обработанной С02 сыворотки надо помнить, что она уже разведена 1:11.

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА)

Сущность РНГА: эритроциты, на которых предварительно адсорбированы

антигены, приобре-

тают способность агглютинироваться в присутствии го-

мологичных сыво-

роток (антител).

Этот феномен по-

ложен в основу ме-

тода обнаружения

и титрования антител.

Рисунок 30 - Схема РНГА.

Эритроциты при этом

102

выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген - антитело и регистрируется визуально по характеру сформированного осадка (рисунок 30).

Следует отличать РНГА от РГА. В РГА эритроциты агглютинируются в ре-

зультате взаимодейст-

вия их рецепторов с ре-

цепторами вирусов (ри-

сунок 31), а в РНГА -

комплексом антиген +

антитело.

Эритроциты, к по-

верхности которых

Рисунок 31 - Схема РГА.

прочно присоединены ан-

тигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом или эрит-

роцитами, сенсибилизированными антигеном. Эритроциты, к поверхности ко-

торых прочно присоединены антитела, называют эритроцитарным антитель-

ным диагностикумом или эритроцитами, сенсибилизированными антитела-

ми.

В качестве носителей (адсорбентов) антигенов или антител могут применять-

ся не только эритроциты, но и частицы целлюлозы, бентонита, латекса и др. До-

вольно широко используют латекс вследствие его стандартности и технологично-

сти изготовления диагностикума (проводят только стадию сенсибилизации).

Методика постановки РНГА включает:

а) приготовление сенсибилизированных эритроцитов (подготовка эритроци-

тов, их фиксация, танизация и сенсибилизация);

б) постановку главного опыта РНГА. Обычно в ветеринарных лабораториях ставят только главный опыт, а сенсибилизированные эритроциты готовят на предприятиях биологической промышленности.

Процесс приготовления эритроцитарного диагностикума:

1. Подготовка эритроцитов. Для этой цели широко применяют эритроциты

103

барана и человека, птиц (кур, индеек, уток); приготовленные на них диагностику-

мы быстрее оседают, что позволяет сократить сроки исследования без потери чувствительности. От соответствующего вида животного берут кровь общеприня-

тым методом. Дефибринированную кровь трижды отмывают изотоническим рас-

твором хлорида натрия при центрифугировании;

2. Фиксация эритроцитов. Преимущество фиксированных эритроцитов в том, что они могут быть заготовлены впрок и длительное время храниться в сус-

пензии, не подвергаясь гемолизу. Для фиксации эритроцитов чаще всего исполь-

зуют формальдегид, глутаровый или акриловый альдегиды. Методики фиксации эритроцитов различны: 50 % взвесь отмытых эритроцитов соединяют с равным объемом 50 % формалина и после двухчасового контакта при 37 °С с периодиче-

ским встряхиванием эритроциты 3 раза отмывают 0,15 M/NaCl (рН 7,2);

3. Танизация эритроцитов. Механизм действия танина на эритроциты мало-

изучен. Однако при этом достигается главное - танизированные эритроциты обла-

дают значительно большей сорбционной емкостью белков. Танизацию формали-

низированных эритроцитов осуществляют путем смешивания равных объемов 3 % взвеси эритроцитов и раствора танина (1:20000). После 10-15-минутного кон-

такта при 37 °С смесь центрифугируют, осадок трехкратно промывают фосфат-

ным буфером (рН 7,2);

4. Сенсибилизация эритроцитов. 10 % концентрацию эритроцитов на 0,15 М

фосфатном буфере (рН 6,4) смешивают с равным объемом вируссодержащей жидкости. Смесь выдерживают 60 мин при 37 °С, периодически встряхивая, затем центрифугируют и 2-3 раза отмывают. Осадок сенсибилизированных эритроцитов разводят до 1 % концентрации в фосфатном буферном растворе (рН 7,2), содер-

жащем 1 % нормальной кроличьей сыворотки (для стабилизации эритроцитов).

Полученные таким образом сенсибилизированные эритроциты используют в РНГА.

Главный опыт РНГА . Реакцию ставят в пробирках или в лунках плекси-

гласовых панелей (рисунок 32). РНГА ставят микрометодом, используя автомати-

104

ческие пипетки (1-, 8-, 12-канальные) с изменяющимися объемами (рисунок 33).

Исследуемые и контрольные сыворотки прогревают при 56 °С 30 мин.

Исследуемую сыворотку разводят двукратно в объеме 0,2 мл физраствором с рН 7,2-7,4, содержащим 1 % нор-

мальной сыворотки кролика, затем к каждому разведению сыворотки до-

бавляют по 0,2 мл сенсибилизирован-

ных антигеном эритроцитов.

Смесь встряхивают и выдер-

ванные эритроциты + физрас-

твор с 1 % кроличьей сыворот-

ки);

2) на активность сенсиби-

лизированных эритроцитов

(сенсибилизированные эрит-

роциты + положительная сы-

воротка);

Рисунок 33 - Автоматические многоканальные

3) на специфичность сен- пипетки. сибилизированных эритроцитов

(сенсибилизированные эритроциты + нормальная сыворотка или другая негомо-

логичная для данного антигена сыворотка); 4) на отсутствие в сыворотках неспецифических гемагглютининов (исследуе-

мые сыворотки + несенсибилизированные эритроциты).

Результаты реакции оценивают по четырехбалльной шкале:

105

+++ - перевернутый «зонтик» с неровными краями;

++ - по краю агглютинированных эритроцитов намечается тонкое кольцо из неагглютинированных эритроцитов;

+ - по краю агглютинированных эритроцитов располагается широкое кольцо из неагглютинированных эритроцитов;

(-) - эритроциты оседают на дно в виде диска (колечка) - отрицательный ре-

зультат.

При положительной реакции эритроциты равномерно распределяются по дну пробирки или луночки в виде зонтика, а при отрицательной - оседают в ви-

де компактного осадка или колечка в центре луночки. Достоверные результаты получают при отсутствии гемагглютинации: испытуемой сыворотки с несенсиби-

лизированными эритроцитами, диагностикума с заведомо отрицательной сыво-

роткой, при положительной реакции диагностикума с заведомо положительной сывороткой.

За титр антител в сыворотке принимают наибольшее ее разведение, кото-

рое еще вызывает агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов.

РНГА позволяет решать задачи: а) обнаруживать антитела и определять их титр в сыворотках крови. Для этого используют эритроциты, сенсибилизиро-

ванные вирусом; б) обнаруживать и идентифицировать вирусный антиген. Для этого используют эритроциты, сенсибилизированные антителами.

Достоинства РНГА: высокая чувствительность (по этому показателю она превосходит РДП, РСК и близка к иммуноферментному методу), простота техни-

ки постановки и быстрота ответа (через 2-3 ч).

Недостатки: трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных ди-

агностикумов (большая зависимость от чистоты компонентов, необходимость подбора режима сенсибилизации для каждого вида вируса и т. д.)

Перечень контрольных вопросов:

1.Принцип РТГА.

2.Модификации РТГА.

3.Постановка РТГА.

106

4.Задачи РТГА.

5.Учет результатов РТГА.

6.Достоинства и недостатки РТГА.

7.Принцип РНГА.

8.Постановка РНГА.

9.Задачи РНГА.

10.Учет результатов РНГА.

11.Достоинства и недостатки РНГА.

Тема 1.10. Метод флуоресцирующих антител (МФА)

Цель: изучить принцип действия и способ постановки метода флуоресци-

рующих антител.

Содержание:

принцип МФА;

задачи, которые можно решить с помощью МФА;

принцип работы люминесцентного микроскопа;

флуорохромирование;

прямой РИФ;

непрямой РИФ.

Многие вещества живых организмов обладают собственной флуоресценцией

(свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим светом и прекра-

щающееся сразу (от 10-9 до 10-7 с) после его окончания), но интенсивность ее очень мала. Вещества, обладающие интенсивной первичной флуоресценцией и использующиеся для придания флуоресцирующих свойств нефлуоресцирующим веществам, получили название флуорохромы (флуоресцирующие красители).

Для возбуждения флуоресценции при люминесцентной микроскопии исполь-

зуют ближнюю ультрафиолетовую или сине-фиолетовую часть спектра. Люми-

несцентная микроскопия осуществляется с помощью специальных микроскопов.

107

Рисунок 34 - Люминесцентный микроскоп.

В люминесцентном микроскопе (рисунок 34) используют систему свето-

фильтров для выделения сине-фиолетовой части спектра (ФС-1, СС-4 + СС-8), те-

плозащитные фильтры для предохранения оптики от перегревания и выцветания препаратов (СЗС-14, СЗС-7, БС-8, кювет с водой или раствором медного купоро-

са) и запирающий фильтр на окуляре для снятия возбуждающего света и про-

пускания света люминесценции (ЖС-18, ЖС-3). Люминесцентный микроскоп ус-

танавливают в затемненной части комнаты на прочном столе. Следует исключить вибрацию, которая создаст помехи, что особенно сказывается при микрофотогра-

фировании. В помещении должна быть хорошая вентиляция, устраняющая вред-

ные газы от источника света. Лампа достигает полной силы света через 5-10 мин после включения, если сила тока при работе равна 4-5 А. Повторное включение лампы возможно только после ее охлаждения.

Большинство исследователей проводят люминесцентную микроскопию пре-

паратов в падающем свете, поскольку он имеет ряд преимуществ перед освеще-

нием препарата снизу: наименьшая потеря света, идущего от источника света,

108

лучший спектральный состав возбуждающего света, незначительное попадание прямого света в глаза исследователя и увеличение освещенности объектов.

При люминесцентной микроскопии используют нефлуоресцирующее иммер-

сионное масло высокого качества. Иногда применяют его заменитель - диметил-

фталат, длительное использование которого может привести к порче объективов.

В вирусологии люминесцентную микроскопию используют в двух основных методах: флуорохромировании и МФА.

Флуорохромирование - это обработка препарата флуорохромом с целью уве-

личения силы и контрастности свечения препарата.

Выпускаются специальные наборы флуорохромов. Наиболее широко приме-

няется акридиновая группа (акридин оранжевый, акридин желтый и др.) и тиози-

ловая группа (примулин). Флуорохром чаще всего используют в водных раство-

рах очень низкой концентрации (1:1000-1:1000000). Метод флуорохромирования может быть использован при изучении некоторых вирусов (оспы, болезни Борна,

аденовирусах и др.).

Наибольший интерес представляет акридиновый оранжевый, который вызы-

вает полихроматическую флуоресценцию НК. Так, при обработке препаратов этим флуорохромом ДНК ярко флуоресцирует желто-зеленым цветом, а РНК - рубино-

во-красным.

Препараты для флуорохромирования готовят двумя способами:

а) на свежий мазок-отпечаток (из органов, соскобов со слизистых оболочек)

или суспензии инфицированных клеток наносят 1-2 капли рабочего раствора

(1:10000) акридинового оранжевого, накрывают покровным стеклом. Приготов-

ленный таким образом свежий (в течение 10-20 мин после его приготовления) пре-

парат рассматривают в люминесцентном микроскопе;

б) мазки-отпечатки, полученные из патматериала, или инфицированные КК

(на покровных стеклах) фиксируют 96 ° этиловым спиртом в течение 15-30 мин,

промывают раствором Хенкса, наносят на препарат 1-2 капли раствора акридино-

вого оранжевого (1:10000), через 5-10 мин накрывают покровным стеклом и ис-

следуют.

109

В результате окрашивания ДНК, содержащаяся в ядрах клеток, дает изум-

рудно-зеленое свечение, РНК, находящаяся в цитоплазме, светится красным или оранжевым цветом. В препаратах ДНК-содержащих вирусов (аденовирусов), ви-

русный материал светится зеленым цветом в ядре в виде гранул различной вели-

чины. При наличии в препарате РНК-содержащего вируса (грипп), вирусный ма-

териал обнаруживается в виде ярко-красных гранул в цитоплазме клеток.

Чтобы различить происхождение ДНК или РНК (клеточное или вирусное),

применяют обработку препаратов 0,5 % раствором РНК-азы или ДНК-азы в тече-

ние 5-10 мин или облучение УФ-лучами. При этом свечение клеточных РНК или ДНК сразу исчезает, а вирусные продолжают светиться еще 20-30 мин. Это слу-

жит доказательством специфичности вирусных НК.

Метод простого флуорохромирования несложен, но он не дает возможности полно дифференцировать возбудителей болезней.

МФА, или реакция иммунофлуоресценции (РИФ). Принцип: антитела, со-

единенные с флуорохромом, сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген + антитело об-

наруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению бла-

годаря присутствию в нем флуорохрома. Таким образом, с помощью МФА реализу-

ется непосредственный контроль за первой фазой серологических реакций, при-

чем специфичность метода сочетается с высокой чувствительностью.

Для получения антител используют высокоактивные гипериммунные проти-

вовирусные сыворотки, максимально освобожденные от гетероантител. Из таких сывороток выделяют гомогенные фракции, содержащие антитела, которые метят флуорохромом. В качестве флуорохрома наиболее часто используют ФИТЦ -

флуоресцеина изотиоционат (зеленое свечение) и РСХ-родамина сульфохлорид

(красное свечение). Антитела, меченные флуорохромом, называют конъюгатом.

Хранить их рекомендуется при температуре минус 20 °С или при более низких температурах в герметически закрытых сосудах. Можно также консервировать конъюгат путем добавления тиомерсала 1:10000 и хранить при температуре 4°С.

110