2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)

 некоторые сведения о вирусе ящура.

Отбор материала: отбирают от 2-3 больных животных стенки и содержи-

мое афт (не менее 5 г) на слизистой оболочке языка у крупного рогатого скота, на пятачке у свиней, на коже венчика и межпальцевой щели у жвачных, свиней,

верблюдов и др. При отсутствии афт берут кровь в момент повышения температу-

ры, у трупов – лимфатические узлы головы и заглоточного кольца, поджелудоч-

ную железу и сердце. Для исследования на вирусоносительство берут пищеводно-

глоточную слизь (специальным зондом).

Получение материала необходимо производить так, чтобы предупредить вы-

нос вируса за пределы неблагополучного очага и лаборатории, обезопасить персо-

нал, работающий с инфекционным материалом. Для этого:

а) ветврач хозяйства должен иметь определенные навыки взятия материала от больных животных;

б) необходимо подготовить все для отбора материала - пинцеты, ножницы,

салфетки, толстостенные флаконы, лейкопластырь, резиновые пробки, 50 % сте-

рильный глицерин на физиологическом растворе, термос с охлаждающей смесью,

дезинфицирующий раствор – 2 % NaOH; спецодежду - халаты, комбинезоны, ко-

сынки или шапочки, маски, резиновые сапоги, перчатки и т. д. Переодеваются,

прежде чем войти в помещение с больными животными;

в) после взятия материала инструменты, маску, перчатки погружают в дезин-

фицирующий раствор, наружную поверхность флаконов и термоса обрабатывают дезинфицирующим раствором. В санпропускнике снимают всю одежду и прини-

мают душ.

Пробы материала замораживают или заливают консервирующей жидкостью

(50 % стерильный глицерин на физиологическом растворе). Этикетируют. Флако-

ны ставят в контейнер, опечатывают и помещают в термос со льдом, который то-

же опечатывают. К материалу прилагают сопроводительное письмо. Материал от-

правляют с нарочным.

Для работы с вирусом ящура в лаборатории выделяют отдельную комнату

(бокс с предбоксником), где должны быть все необходимое оборудование и мате-

161

риалы для проведения диагностической работы. При работе в боксе полностью сменяют спецодежду и обувь, надевают резиновые перчатки и маску. После рабо-

ты ничего не обезвреженного из бокса выносить нельзя.

В лаборатории ведут строгий учет поступившего материала и его расход с точностью до 1 мг. Поступивший в лабораторию материал хранят до исследования и в период использования в закрытом на ключ и опечатанном холодильнике. По окончании работы составляют акт на уничтожение оставшегося от исследования материала и животных после биопробы.

Лабораторные исследования

1. обнаружение и идентификацию вируса ящура в РСК (определение его ти-

повой и вариантной принадлежности);

2. обнаружение и титрование антител к ящуру у переболевших животных

(реконвалесцентов) в реакции радиальной иммунодиффузии (РРИД) и непрямой РИФ (НРИФ).

РСК На первом этапе участвуют антиген, антитело (один из этих ингредиентов из-

вестен) и предварительно оттитрованный комплемент. При соответствии антигена и антитела их комплекс связывает комплемент, что выявляют на втором этапе с помощью индикаторной системы (смесь бараньих эритроцитов и антисыворотки к ним - гемолизина). Если комплемент связался при взаимодействии антигена и ан-

титела, то лизиса эритроцитов не происходит - положительная РСК. При отрица-

тельной РСК несвязанный комплемент способствует гемолизу эритроцитов.

Основными компонентами РСК служат антигены (известные или выявляе-

мые), антитела (известные антисыворотки или исследуемые сыворотки), компле-

мент (свежая или сухая нормальная сыворотка морских свинок), гемолизин и эритроциты барана; в качестве разбавителя используют физраствор (рН 7,2-7,4)

или различные буферные растворы. Антигены и сыворотки могут обладать анти-

комплементарностью, т.е. способностью адсорбировать комплемент, что задер-

живает гемолиз и искажает результаты реакции. Чтобы избавиться от антиком-

плементарности, антигены очищают различными методами: ацетоном, фреоном,

162

эфиром, хлороформом и т.д. в зависимости от вида ткани, используемой в качестве антигена и вируса. Сыворотки освобождают от антикомплементарности путем про-

гревания, обработкой комплемента и другими методами.

Антигены готовят из органов зараженных животных, аллантоисной, амниоти-

ческой жидкости зараженных КЭ, из жидкой среды инфицированных КК.

Подготовка антигена для РСК при вирусных инфекциях отличается от его под-

готовки при бактериальных инфекциях. Это обусловлено рядом специфических свойств вирусов.

1. для освобождения вирусного антигена из клетки приходится часто допол-

нительно обрабатывать инфекционный материал с целью разрушения клеток и освобождения антигена.

2. большая термолабильность вирусных антигенов по сравнению с бактери-

альными. У большинства вирусов комплементфиксирующий антиген связан с ин-

фекционной частицей, и разрушение его идет параллельно с потерей инфекцион-

ности. Поэтому материалы для получения антигена необходимо брать от павших животных только в первые часы после гибели их, а лучше при жизни. Кон-

сервирование вируссодержащего материала различными дезинфицирующими средствами часто не дает положительных результатов, т.к. многие из них вызы-

вают разрушение вирусного антигена.

3. неравномерность фиксации комплемента при различном соотношении кон-

центраций антиген + антитело. Комплекс антиген + антитело образуется только при строгих количественных соотношениях их; при избытке антител фиксация комплемента резко снижается, т.к. активный комплекс антиген + антитело пред-

ставлен в основном в форме антител и активная поверхность комплемента незна-

чительна. То же самое наблюдается и в зоне избытка антигена, где подавление фиксации комплемента происходит еще быстрее. Поэтому для установления оп-

тимальной зоны фиксации комплемента необходимо предварительное титрование антигена и антител.

4. незначительный объем комплекса антиген + антитело. Размер вирусных частиц, вступающих в комплекс, очень ничтожен, и поэтому площадь фиксации

163

комплемента незначительна. С увеличением объема комплекса антиген + антитело путем удлинения периода фиксации комплемента (до 18 ч при 4°С) повышается чувствительность реакции, но снижается ее специфичность, т.к. при продолжи-

тельном периоде фиксации увеличивается фиксация комплемента неспецифиче-

скими антигенами (тканевыми).

5. высокая прокомплементарная активность вирусного антигена. Для исклю-

чения неспецифической фиксации комплемента необходима более полная очистка вирусного антигена от тканевых фрагментов.

Большой помехой для использования РСК в диагностике вирусных болезней животных и человека является неравномерное накопление вирусного антигена в различные периоды болезни, и особенно, при разных инфекциях.

РСК применяют для определения типов и подтипов (вариантов) вируса ящу-

ра, вызывающих заболевание, для проверки производственных штаммов вируса ящура при изготовлении вакцин и лабораторных штаммов в научно-

исследовательской работе.

Приготовление антигена вируса ящура. Стенки афт от больных живот-

ных отмывают от консервирующей жидкости физраствором, высушивают, взве-

шивают, измельчают и тщательно растирают со стерильным стеклом до получе-

ния однородной массы, к которой добавляют физиологический раствор. Получен-

ную 33 % суспензию экстрагируют при комнатной температуре в течение 2 ч,

промораживают при минус 10 – минус 20 °С в течение 5 - 18 ч. После разморажи-

вания центрифугируют 30-15 мин. Надосадочную жидкость инактивируют при 58 °С 40 мин. После инактивации, если жидкость с хлопьями, ее повторно центри-

фугируют при 10-15 мин и затем используют в качестве антигена в РСК.

Подготовка гемолизина. Гемолизин титруют при получении его новой се-

рии. Выпускаемый биофабриками гемолизин иногда консервирован глицерином

(1:1), поэтому для приготовления основного разведения гемолизина (1:1000) бе-

рут 0,2 мл гемолизина и 9,8 мл физиологического раствора (1:100), затем из этого разведения готовят разведение 1:1000 (к 1 мл гемолизина 1:100 добавляют 9 мл физиологического раствора). Из основного раствора (1:1000) готовят все после-

164

дующие по указанной схеме. Получив необходимые разведения гемолизина,

проводят его титрование по схеме таблицы.

При титровании гемолизина необходимы:

1) контроль эритроцитов для исключения спонтанного гемолиза (0,5 мл 2 %

суспензии эритроцитов + 2 мл физиологического раствора); 2) контроль гемолизина для исключения гемолиза эритроцитов без комплемен-

та (0,5 мл разведения 1:1000 гемолизина + 0,5 мл 2 % суспензии эритроцитов + 1,5

мл физиологического раствора); 3) контроль комплемента для исключения гемолиза эритроцитов без участия

гемолизина (0,5 мл разведения 1:20 комплемента + 0,5 мл 2 % суспензии эритро-

цитов + 1,5 мл физиологического раствора); 4) контроль гемолитической системы (0,5 мл разведения 1:1000 гемолизина +

0,5 мл 2 % суспензии эритроцитов + 0,5 мл разведения 1:20 комплемента + 1,0 мл физиологического раствора).

В результате титрования устанавливают предельный титр гемолизина, т.е. его минимальное количество, способное вызвать лизис эритроцитов (гемолиз) в при-

сутствии комплемента. На приведенной схеме это количество гемолизина получе-

165

но в разведении 1:3000. В первых трех контролях должна быть полная задержка, в

четвертом контроле - полный гемолиз.

В главный опыт берут гемолизин в 4-кратной концентрации от его предельного титра (рабочее разведение). Например, предельный титр гемолизина 1:3000, его ра-

бочее разведение будет 1:750. А если он консервирован глицерином (1:1), то для приготовления рабочего разведения берут 2:750 или 0,2 мл цельного гемолизина и

74,8 мл физиологического раствора.

Приготовление гемолитической системы (гемосистемы). Смешивают ге-

молизин в рабочем разведении с равным количеством 2 % взвеси эритроцитов ба-

рана. Перед использованием гемосистему выдерживают в термостате при 37 °С 30

мин для сенсибилизации эритроцитов.

Приготовление 2 % суспензии эритроцитов барана. На 2 мл осадка отмы-

тых эритроцитов добавляют 98 мл физиологического раствора.

Требование комплемента. Комплемент титруют в день постановки главного опыта в гемолитической системе по указанной схеме.

Титром комплемента считается то его наименьшее количество, которое вы-

зывает полный гемолиз эритроцитов. При определении типа вируса ящура ис-

пользуют комплемент с титром не ниже 2,5 %.

166

Для постановки главного опыта РСК комплемент берут с излишком в 1 %

или в две условные единицы от титра его в гемосистеме. Например, титр компле-

мента в гемосистеме 2 %, в главный опыт берут 3 %, для приготовления рабочей дозы к 3 мл нативного цельного комплемента добавляют 97 мл физиологического раствора.

Приготовление разведений комплемента, определение его активности и вы-

числение рабочей дозы требуют в подготовке РСК наибольшего внимания. Пра-

вильно избранная рабочая доза комплемента - непременное условие нормального течения реакции, что обеспечивает достоверность результатов. Избыток компле-

мента ведет к частичной или полной потере возможности выявить специфический антиген или антитело. Недостаток комплемента вызывает задержку гемолиза и при отсутствии специфического антигена и антитела.

Сыворотки. При определении типа вируса ящура позитивные типоспецифиче-

ские ящурные сыворотки используют в рабочем титре, который представляет со-

бой удвоенный предельный титр. Так, если предельный титр сыворотки, указанный на этикетке, равен 1:40, то рабочий титр - 1:20.

Антигены. Типоспецифические ящурные антигены (выпускаемые биофабри-

ками) используют в удвоенных титрах. Так, если на этикетке указан предельный титр 1:6, то удвоенный титр его 1:3.

В качестве испытуемого антигена используют патматериал (стенки и содер-

жимое афт, тушки больных и павших при постановке биопробы мышат и кроль-

чат), культуральную вируссодержащую жидкость. Испытуемый антиген в реак-

ции исследуют цельным (33 % взвесь) и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8.

Постановка главного опыта для определения типа вируса ящура. Одно-

временно с главным опытом ставят контроль всех специфических ящурных анти-

генов и сывороток.

Компоненты разливают в следующем порядке:

1) специфические сыворотки в рабочем титре по 0,2 мл для каждой сыворот-

ки - один ряд пробирок по вертикали;

167

2)специфические антигены в рабочем титре по 0,2 мл - в первые семь рядов по горизонтали, для каждого антигена один ряд;

3)испытуемый антиген в разведениях по 0,2 мл - для каждого разведения один ряд пробирок по горизонтали;

4)физиологический раствор по 0,2 мл - в последний ряд по горизонтали (кон-

троль сывороток) вместо антигена и в последний ряд по вертикали (контроль ан-

тигенов) вместо сывороток;

5)комплемент по 0,2 мл в рабочем разведении - во все пробирки главного опыта. Пробирки осторожно встряхивают и помещают в водяную баню на 20 мин при 37-38 °С;

6)во все пробирки наливают по 0,4 мл гемолитической системы. Пробирки снова встряхивают и помещают в водяную баню на 30 мин при 37-38 °С.

Учет реакции ведут через 5-10 мин после водяной бани, и окончательный ре-

зультат получают через 10-12 ч. Степень задержки гемолиза оценивают в крестах:

(+ + + +) – 100 % задержка гемолиза; (+ + +) – 75 % задержка гемолиза; (+ +) – 50

% задержка гемолиза; (+) – 25 % задержка гемолиза; (-) - полный гемолиз.

Если испытуемый антиген гомологичен специфическим антителам, то будет задержка гемолиза и реакция положительная; если же гомологичные антитела от-

сутствуют, реакция отрицательная и наблюдается полный гемолиз.

При установлении типовой принадлежности ящура используют вариантные сыворотки и антигены установленного типа, причем вариантные сыворотки ис-

пользуют в предельном титре, а антигены - в удвоенном. Антиген (исследуемый)

относят к тому варианту, с сывороткой которого он дает положительную реакцию в более высоких разведениях.

168

Заключение: испытуемый штамм относится к варианту А22.

Когда доставленное количество вирусного материала из хозяйства недостаточ-

но для исследования в РСК, проводят его расплодку на культурах клеток или на 3- 6-дневных мышатах-сосунах, или взрослых морских свинках. Мышатам исследуе-

мую суспензию вводят подкожно в области спины в дозе 0,1-0,2 мл, морским свин-

кам – внутрикожно в подушечки обеих задних конечностей в дозе 0,2-0,5 мл. За животными наблюдают 5-7 дней.

В случае гибели мышат из их тушек готовят антиген для РСК. У морских свинок в положительных случаях на лапках образуются афты; стенки афт и их со-

держимое используют в РСК. При необходимости проводят 2-3 «слепых» пассажа.

Пробу исследуемого материала считают отрицательной, если в третьем пассаже не будет отмечено дегенерации клеток и падежа белых мышей, а при исследовании полученных из них суспензий в РСК не будет обнаружен антиген вируса ящура.

Ретроспективная диагностика ящура

Материалом служат сыворотки крови животных. Они должны быть взяты не ранее 7 дней с момента появления признаков заболевания. На исследование сле-

дует направлять 5-10 проб сыворотки от каждой возрастной группы. При сомни-

тельных результатах первичного исследования необходимо отобрать кровь по-

вторно от тех же животных спустя 7 - 10 дней.

169

Сыворотку консервируют антибиотиками (по 500 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина) или замораживают при -20°С. На исследование направляют не ме-

нее 5 мл сыворотки от каждого животного в термосе со льдом.

В лаборатории сыворотку исследуют с помощью РРИД и НРИФ.

РРИД. Сущность заключается в формировании зоны специфической преци-

питации вирусных антигенов антителами, включенными в состав агарового геля.

РРИД является типоспецифичной. Для постановки реакции расплавленный 2 %

агар смешивают с равным объемом нагретой (50-55 °С) испытуемой сыворотки в разведениях 1:5, 1:10, 1:20 и т.д. до 1:320 и наносят (по 4 мл) на предметное стек-

ло. В застывшем агаре вырезают лунки (диаметр 4-7,7 мм), которые заполняют эталонными типовыми антигенами. Затем стекла помещают во влажную камеру при 37 °С.

Учет результатов через 6 - 7 ч и окончательно через 18 ч.

Положительная реакция - кольцо преципитации в виде опалесцирующей зо-

ны вокруг лунки с антигеном, гомологичным возбудителю, вызвавшему заболева-

ние.

Антитела, обнаруженные в испытуемой пробе сыворотки, относят к тому се-

ротипу, с антигеном которого они дали положительную реакцию. Их титром счи-

тают максимальное разведение испытуемой сыворотки, с которым наблюдается положительная реакция.

После переболевания животных титры антител обычно превышают 1:160.

НРИФ. Наличие антител в сыворотке крови переболевших животных выяв-

ляет специфическое свечение (комплекса антиген + антитело), а при использова-

нии сывороток от вакцинированных животных свечение комплекса не на-

блюдается. На препарат из КК ВНК-21, ПЭК, ПЭС, инфицированных ящуром лю-

бого типа, наносят испытуемую сыворотку (в разведении 1:10 и 1:20), инкубируют во влажной камере при 37 °С 30 мин, отмывают несвязавшиеся антитела, подсу-

шивают на воздухе и окрашивают смесью рабочих разведений флуоресцирующей антивидовой сыворотки и бычьего альбумина, меченного родамином, инкубиру-

ют во влажной камере при 37 °С 30 мин, отмывают, подсушивают и просматрива-

170