2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)

Флуоресцирующие сыворотки или их глобулиновые фракции длительное время сохраняют специфическую активность в лиофилизированном состоянии.

При использовании каждой серии конъюгата необходимо опытным путем проверить рабочее разведение, т.к. оно зависит от качества флуоресцирующей сыворотки и от освещения препарата в люминесцентном микроскопе. С этой це-

лью микроскопируют препараты, содержащие специфический антиген, окрашен-

ные конъюгатом, взятым в разных разведениях (обязательно на 1-2 разведения выше и ниже рабочего разведения, указанного на этикетке препарата), выбирают наибольшее разведение, дающее интенсивное свечение (красящий титр), и удваи-

вают его.

Приготовление препаратов. Используют мазки, отпечатки, гистосрезы и культуры клеток .

Предметные стекла для приготовления препаратов должны быть тонкими,

чистыми, обезжиренными, бесцветными и не иметь царапин. Для этого их про-

мывают в нейтральных детергентах, прополаскивают в дистиллированной воде и сохраняют в спирте или смеси спирта с эфиром. Перед употреблением чистые стекла проводят через пламя горелки и охлаждают. Все надписи делают простым карандашом на специально подготовленной матовой площадке у края предметно-

го стекла. Надписи восковым карандашом при фиксации препаратов растворяют-

ся и образуют на стекле восковую пленку, мешающую обработке мазков флуорес-

цирующими сыворотками.

Мазки готовят из смывов и других жидкостей. Мазки-отпечатки готовят из тех органов и тканей, в которых предполагается наибольшая концентрация вируса.

Для диагностики бешенства применяют мазки-отпечатки из мозга; ринопневмонии лошадей, гепатита собак - из печени; гриппа, ИРТ КРС, аденовирусной инфекции и других - мазки из носовых смывов, а также отпечатки слизистых оболочек носо-

вой полости, бронхов, трахеи; оспы - мазки из везикул, папул.

Для выявления вируса гриппа или других возбудителей респираторных болез-

ней очищают носовой ход от слизи, берут мазок ватным тампоном, который поме-

щают в пробирку с забуференным физраствором или питательной средой для КК

111

(3 мл). Тампон встряхивают, отжимают и удаляют, раствор центрифугируют и из осадка делают мазки диаметром 1,5 см каждый на стекле. Исследование слизистых оболочек, выстланных многослойным плоским эпителием, например, глотки,

конъюнктивы, влагалища, требует приготовления соскобов после очистки слизи-

стой оболочки. Поверхностные ороговевшие клетки таких эпителиев обладают сильной аутофлуоресценцией и не годятся для исследования. Поэтому препараты готовят из клеток скарифицированных участков, содержащих базальные слои эпи-

телия.

Из органов готовят отпечатки, прикладывая быстрым движением предметное стекло к поверхности органа. Отпечаток должен быть тонким и равномерным.

Мазки-отпечатки подсушивают на воздухе, затем фиксируют и сохраняют в холодильнике до исследования (при минус 4°С, минус 70°С).

Для контроля таким же образом готовят препараты из органов здоровых жи-

вотных.

Если вирусы предварительно накапливают в КК, то последние выращивают на узких пластинках покровного или такого же размера обрезках предметного стекла.

Извлеченные в разные сроки после заражения из пробирок с КК, эти пластинки ос-

торожно отмывают от питательной среды физраствором или фосфатным буфером.

Затем сушат при комнатной температуре на воздухе на чистом листе фильтроваль-

ной бумаги, положив клеточным слоем вверх, и фиксируют.

Наилучший фиксатор для вирусных антигенов - чистый ацетон, охлажденный до минус 10 - минус 15 °С; можно также использовать метиловый спирт. Фикси-

руют препараты 10-20 мин. Продолжительность и температура фиксации могут колебаться в зависимости от вида вируса. При особо опасных инфекциях время фиксации увеличивают. Например, при работе с уличным вирусом бешенства препараты фиксируют не менее 4 ч.

Различают два основных способа применения флуоресцирующих антител:

прямой и непрямой.

112

При использовании прямого, или

одноступенчатого, способа (Weller и

Coons, 1954) для индикации различных вирусных антигенов применяют соот-

ветствующие каждому антигену флуо-

ресцирующие антитела. Непосредст-

венно на препарат наносят конъюгат и выдерживают в течение 20-60 мин при

температуре 37 °С во влажной камере, Рисунок 35 - Свечение вируса при РИФ. некоторые исследователи предпочита-

ют проводить эту процедуру при 4 °С, удлиняя время. Препараты отмывают физра-

створом (рН 7,2-7,5) от не связанного с антигеном конъюгата. Затем их подсуши-

вают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под микроско-

пом.

Результаты учитывают по интенсивности и специфичности флуоресценции исследуемого объекта с учетом структурных особенностей по следующей шкале

(рисунок 35):

(++++) - яркая, сверкающая флуоресценция изумрудно-зеленого цвета;

(+++) - яркая флуоресценция зеленого цвета;

(++) - слабая флуоресценция желтовато-зеленого цвета;

(+) - очень слабая флуоресценция неопределенного цвета;

(-) - объект не флуоресцирует.

В качестве обязательного контроля берут препараты из материалов, не содер-

жащих искомый вирус (нормальные тканевые культуры, отпечатки органов здоро-

вых животных и т. п.). Их обрабатывают так же, как опытные препараты, и одно-

временно с ними.

Выпускаемые биофабриками сухие специфические иммунные люминесци-

рующие сыворотки и альбумины перед окрашиванием мазков растворяют в дис-

тиллированной воде в объеме, указанном на этикетке ампулы. Хорошие препара-

ты должны легко и без осадка растворяться. Если при этом препарат мутнеет или

113

образуется осадок, то от мути или осадка освобождаются центрифугированием при 6000 мин-1. Растворенными препаратами, сохраняемыми при 4°С, можно пользоваться в течение нескольких недель. Перед обработкой исследуемых пре-

паратов готовят рабочую смесь специфического конъюгата с люминесцирующим альбумином. Наиболее выгодное соотношение между флуоресцирующим иммун-

ным глобулином, меченным ФИТЦ, и альбумином, конъюгированным с родами-

ном, приходится определять опытным путем для каждой новой серии любого из этих препаратов, ибо характеристика их активности с момента выпуска до приме-

нения может изменяться.

Прямой метод позволяет выявить и идентифицировать антиген. Для этого нужно иметь на каждый вирус флуоресцирующую сыворотку.

При непрямом, или двухступенчатом, способе вначале антиген обрабаты-

вают гомологичными нефлуоресцирующими антителами (1-я ступень). Образует-

ся комплекс антиген + антитело, для обнаружения которого применяют флуорес-

цирующую антивидовую сыворотку, соответствующую виду животного - проду-

цента гомологичных антител. Антивидовые сыворотки получают, иммунизируя животных глобулинами животных тех видов, которые служат прдуцентами анти-

вирусных антител. Чаще применяют антикроличьи, антилошадиные и сыворотки против глобулинов морской свинки.

При непрямом методе на фиксированный препарат (как описано выше) нано-

сят немеченую сыворотку или гаммаглобулины, содержащие антитела к предпо-

лагаемому вирусу, после чего препарат в течение 30 мин выдерживают при темпе-

ратуре 37°С. Отмывают несвязанные антитела. На препарат наносят конъюгат, со-

держащий антитела против гаммаглобулинов животных того вида, на которых по-

лучали антивирусные антитела, т.е. если использовали антитела, полученные на курах, то применяют меченные флуорохромом антитела против глобулинов кур.

Время окрашивания этим конъюгатом такое же, как и при прямом методе.

Препарат отмывают для удаления несвязанных меченых антител, наносят не-

флуоресцирующее масло и исследуют под люминесцентным микроскопом.

114

Непрямой способ имеет ряд преимуществ. Его применяют не только для об-

наружения антигена, но и для выявления и титрования антител. Этот метод в не-

сколько раз более чувствителен, чем прямой, т.к. каждая молекула антигена свя-

зывает обычно больше чем одну молекулу антитела. Эти антитела, соединяющие-

ся с изучаемым антигеном, в свою очередь, являются антигенами для флуоресци-

рующего антиглобулина, которого связывается значительно больше. Кроме того,

этот метод требует одной меченой сыворотки для обнаружения антигенов различ-

ных вирусов.

Оба варианта непрямого метода применяются как для обнаружения и иден-

тификации антигена, так и для выявления и титрования специфических антител.

Микроскопирование мазков из заведомо известных вируссодержащих материа-

лов, обработанных различными разведениями исследуемых сывороток, позволяет обнаруживать специфические антитела и определять их титр в этих сыворотках.

Этот метод существенно упрощает и ускоряет серологическую диагностику ви-

русных инфекций.

Благодаря специфичности, высокой чувствительности, доступности, быстро-

те и относительной простоте МФА используется с целью индикации и идентифи-

кации вирусных антигенов (особое значение приобретает этот метод для тех ви-

русов, которые не обладают цитопатогенными, гемагглютинирующими и гемад-

сорбирующими свойствами); выявления и титрования противовирусных антител.

Перечень контрольных вопросов:

1.Принцип работы люминесцентного микроскопа.

2.Флуорохромы.

3.Конъюгаты.

4.Подготовка препаратов к исследованию.

5.Флуорохромирование.

6.Прямой РИФ.

7.Непрямой РИФ.

8.Задачи, которые можно решить с помощью постановки РИФ.

9.Достоинства и недостатки РИФ.

115

Тема 1.11. Иммуноферментный анализ (ИФА)

Цель: изучить принцип действия и способ постановки иммуноферментного

анализа.

Содержание:

гистохимический вариант ИФА: прямой пероксидазный тест;

гистохимический вариант ИФА: непрямой пероксидазный тест;

твердофазный иммуноферментный анализ (Elisa-тест);

задачи, которые можно решить с помощью ИФА;

достоинства ИФА;

подготовка препаратов к исследованию.

Это методы, основанные на использовании в качестве метки антигенов и антител ферментов. ИФА используют в медицине, сельском хозяйстве, промышленности и контроле окружающей среды. Основные направления применения ИФА: ранняя диагностика инфекционных, онкологических и других болезней, проведение мас-

совых эпидемиологических и эпизоотологических исследований, контроль каче-

ства продукции и соблюдение санитарных норм на предприятиях медицинской,

микробиологической и пищевой промышленности.

ИФА используется для выявления и идентификации вируса и антител к нему

(у животных-реконвалесцентов) или исследования уровня поствакцинальных ан-

тител.

Применяют две модификации ИФА.

Гистохимический вариант ИФА, или иммунопероксидазная реакция ана-

логична методу иммунофлуоресценции, но отличается тем, что для постановки реакции используют антитела, меченные не флуорохромом, а ферментом, и учет результатов реакции проводят не под люминесцентным микроскопом, а под обычным световым. В этом варианте ИФА используют антитела, меченные пе-

роксидазой, т.к. ее молекулярная масса (40000) меньше, чем молекулярная масса щелочной фосфатазы (100000) и галактозидазы (150000), что способствует луч-

шему проникновению пероксидазного конъюгата сквозь клеточную мембрану.

Кроме того, пероксидаза устойчива при гистологической обработке.

116

Рисунок 36 - Схема прямого пероксидазного теста.

Материалом для выявления вирусоспецифических антигенов или вирусов с помощью иммунопероксидазнои реакции служат мазки-отпечатки различных ор-

ганов, парафиновые срезы, культуры клеток, мазки крови. Использование для им-

мунопероксидазнои реакции носоглоточных смывов несколько ограничено в свя-

зи с наличием в воспаленных клетках большого количества эндогенной перокси-

дазы, обусловливающей высокое фоновое окрашивание. Для инактивации эндо-

генной пероксидазы применяют азид натрия в сочетании с перекисью водорода и фенилгидразин. Обработку указанными реактивами проводят перед нанесением иммуноферментного конъюгата на препарат.

Иммунопероксидазную реакцию ставят в прямом и непрямом вариантах.

Прямой пероксидазный тест (рисунок 36). При выявлении антигена с по-

мощью этого метода используют противовирусные конъюгаты, т.е. конъюгаты,

полученные из антител, выделенные из специфической сыворотки, и фермент.

Конъюгаты готовят в специализированных учреждениях биопромышленности.

Для выявления вирусоспецифического антигена прямым иммунопероксидазным методом проводят этапы работы, представленные на рис.

Для этого культуру клеток, выращенную на покровных стеклах и инфициро-

ванную вирусом, или мазки-отпечатки в течение 10 мин фиксируют охлажденным до минус 10 - минус 20 °С ацетоном. Препараты высушивают на воздухе и наносят

117

на них 0,2-0,3 мл иммунопероксидазного конъюгата в рабочем разведении, кото-

рое указано на ампуле. Инкубируют 1-2 ч при 37 °С во влажной камере. Препарат в течение 15 мин тщательно промывают физраствором, споласкивают дистиллиро-

ванной водой и высушивают на воздухе. Наносят на него несколько капель ра-

створа субстрата - диаминобензидинтетрахлорида, инкубируют 5-10 мин и промы-

вают 10-15 мин в физиологическом растворе, споласкивают дистиллированной во-

дой.

В положительных случаях, т.е. при наличии антигена в исследуемом препа-

рате, после нанесения иммунопероксидазного конъюгата образуется комплекс ан-

тиген-антитело, меченный ферментом. После нанесения на препарат раствора субстрата последний под действием фермента разлагается, образуя цветной про-

дукт ферментативной реакции, хорошо видный в световом микроскопе.

Результаты учитывают с помощью светового микроскопа. Диами-

нобензидинтетрахлорид под действием пероксидазы разлагается, образуя продукт реакции голубого цвета, который быстро переходит в коричневый. В препарате видны или диффузное желто-коричневое окрашивание, или гранулы коричнево-

черного цвета. В контрольных препаратах окрашивания не обнаруживают.

Непрямой иммунопероксидазный тест применяют для выявления вирусос-

пецифического антигена. При этом используют антивидовые иммунопероксидаз-

ные конъюгаты, приготовленные в специализированных учреждениях. Преиму-

ществом непрямого метода является универсальность меченых антивидовых гло-

булинов, а также большая чувствительность его по сравнению с прямым.

118

Рисунок 37 - Схема непрямого пероксидазного теста.

Для выявления вирусоспецифического антигена культуру клеток, выращен-

ную на покровных стеклах и инфицированную вирусом, или мазки-отпечатки фик-

сируют в течение 10 мин охлажденным (минус 10 - минус 20 °С) ацетоном. Препа-

раты высушивают на воздухе и наносят на них 0,2-0,3 мл специфической к иско-

мому антигену сыворотки. Инкубируют при 37 °С 1-2 ч во влажной камере. Про-

мывают физраствором 5 мин и высушивают на воздухе. Наносят 0,2-0,3 мл анти-

видового иммунопероксидазного конъюгата в рабочем разведении, указанном на ампуле, и инкубируют при 37 °С 1-6 ч. Далее следуют процедуры, которые были описаны для прямого метода (рисунок 37).

При наличии в исследуемом материале вирусоспецифического антигена по-

сле внесения специфической сыворотки образуется комплекс антиген-антитело,

для выявления которого используют антивидовые или вторичные антитела, ме-

ченные ферментом; образуется более сложный, чем в первом случае, комплекс:

антиген-антитело-вторичное антитело-фермент. Полученный комплекс выявляют добавлением субстрата, который под действием фермента разлагается, образуя цветной продукт ферментативной реакции. Учет результатов проводят, как и в первом случае, в световом микроскопе.

Иммунопероксидазная реакция в прямом и непрямом вариантах используется для выявления вирусов бешенства, ящура, герпесвирусов, энтеровирусов и др.

119

Методы твердофазного иммуноферментного анализа основаны на приме-

нении антител (антигенов), фиксированных на нерастворимых носителях. В каче-

стве носителей используют стеклянные или нейлоновые шарики, полистироловые или керамические пробирки и микропанели. В последнее время широкое исполь-

зование в ИФА получили полистироловые микропанели. Применение их и авто-

матизация процесса постановки и учета реакции позволяют за короткое время ис-

следовать большое число образцов сывороток на наличие антител и другого мате-

риала на наличие вирусоспецифического антигена.

Твердофазный ИФА был предложен в 1971 г. Он успешно используется для обнаружения вирусоспецифического антигена, специфических антител у живот-

ных-реконвалесцентов или иммунизированных противовирусными вакцинами.

В твердофазном ИФА используют как пероксидазные, так и щелочно-

фосфатазные конъюгаты.

Для исследования большого числа образцов с помощью твердофазного ИФА необходимо иметь: полистироловые микропанели с плоским дном, автоматиче-

ские пипетки с переменным или постоянным объемом от 50 до 200 мкл, промы-

вочное устройство - автоматическое или полуавтоматическое и считывающее уст-

ройство. Анализ может быть выполнен на микропанелях и без перечисленных выше приборов. В этом случае учет результатов реакции может быть проведен ви-

зуально, без использования специальной регистрирующей аппаратуры, но в этом случае резко снижается производительность метода.

Для выявления вирусоспецифического антигена с помощью данного метода в различных биологических жидкостях наиболее часто используют метод двойных антител, или «сандвич».

Твердофазный иммуноферментный тест для обнаружения вирусоспецифиче-

ского антигена ставят по следующей схеме (рисунок 38):

120