2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)

Рисунок 43 - Принцип ПЦР.

комплементарное связывание праймера с ДНК-матрицей (отжиг);

синтез ДНК с помощью ДНК-полимеразы (достройка праймера) и состав-

ляют суть каждого цикла ПЦР.

Далее этот стандартный цикл ПЦР - плавление, отжиг, синтез - воспроизво-

дится многократно, и в идеале количество амплификонов растет в геометрической прогрессии.

Продолжительность реакции определяется числом циклов, необходимых для синтеза ДНК амплификонов в количестве, достаточном для дальнейшего исследо-

вания или индикации. Индикация может быть произведена электрофорезом с ок-

рашиванием бромистым этидием, гибридизацией с изотопно или неизотопно ме-

ченными генными зондами, непосредственным колориметрическим, флуоромет-

рическим, радиоизотопным определением при использовании в системе ПЦР ме-

ченых предшественников синтеза НК.

131

Основными компонентами ПЦР являются:

фермент Taq-ДНК-полимераза;

пара олигонуклеотидных праймеров;

четыре типа дезоксинуклеозидтрифосфатов.

Вспомогательными компонентами являются буферный раствор и минераль-

ПЦР в идентификации ДНК- и РНК-содержащих вирусов еще больше возросли с выделением новой полимеразы (из термофильного микроорганизма Thermus thermophilus), обладающей как полимеразной, так и обратнотранскриптазной ак-

тивностью. С помощью этого фермента упрощается выявление РНК-содержащих вирусов в ПЦР.

Праймеры для ПЦР имеют длину 20-30 нуклеотидов, должны быть компле-

ментарны выбранному месту в матрице. Особенно жесткие требования предъяв-

ляются к комплементарности 3'-концевой части праймера, в то время как в сред-

ней и 5'-концевой его части допустимы нуклеотидные замены. Чем больше нук-

леотидов в праймере, тем специфичнее ЦПР; короткие праймеры часто «ошиба-

ются».

132

Дезоксинуклеозидтрифосфаты: дАТФ, дТТФ, дГТФ и дЦТФ в реакцион-

ной смеси содержатся в эквивалентных концентрациях, т.к. избыток какого-либо из них увеличивает ложное спаривание нуклеотидов в ПЦР.

Магний необходим для функционирования фермента Taq-ДНК-полимеразы.

Буфер должен обеспечивать оптимальные условия для работы фермента.

Наиболее распространен трис-НС1-буфер (рН6,8-7,8), содержит желатин или бы-

чий сывороточный альбумин и неионные детергенты для стабилизации фермента.

Минеральное масло наслаивается на поверхность реакционной смеси для

предотвращения испарения в процессе ПЦР.

Технология идентификации ДНК-содержащих вирусов: из исследуемого ма-

териала выделяется ДНК-матрица; в пробирке смешивают ДНК, праймеры, де-

зоксирибонуклеозидтрифосфаты, буфер и ДНК-полимеразу. На первом этапе

пробирка с инкубационной смесью нагревается до температуры дена-

турации ДНК (90-100 °С), при этом две цепи ДНК расходятся. Затем проба инкубируется при темпера-

плементарное достраивание нитей ДНК-матрицы с помощью дезоксирибонуклео-

зидтрифосфатов (72 °С). В результате проведенного цикла происходит удвоение искомого генетического материала. В следующем цикле синтез осуществляется с

4 копий, далее с 8 и т. д. до 20-30 циклов. В результате получают миллионы копий специфического участка ДНК вируса, бактерий или клеток крови. Индикацию амплифицированного генетического материала проводят одним из вышеуказан-

ных методов (рисунок 45).

Любая из вновь синтезированных цепей ДНК служит матрицей для синтеза молекул ДНК, соответствующих по длине и последовательности участку ДНК,

133

выбранному для амплификации. Праймеры ориентированы так, что синтез с по-

мощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий заданного участка ДНК. Оптимальное расстояние между праймерами (длина ам-

плифицируемого участка) составляет 200-500 пар нуклеотидов. Практически уда-

ется амплифицировать фрагменты ДНК длиной до 3-4 тыс., хотя можно достичь и

10 тыс. пар нуклеотидов. Следовательно, теоретически за 20 циклов ПЦР можно получить амплификацию заданного участка ДНК в миллион раз. В то же время длинные неограниченные копии ДНК могут синтезироваться только с исходных, «родительских» цепей ДНК, и за 20 циклов ПЦР может образоваться лишь 20 та-

ких копий каждой из «родительских» цепей, это очень мало по сравнению с коли-

чеством основного продукта.

Кинетика ПЦР имеет экспоненциальный характер только на начальном этапе

(20-25 циклов), после чего начинается выход на плато (после 40-45 циклов) в силу истощений дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и нарастающего темпера-

турного повреждения Taq-ДНК-полимеразы, конкуренции за фермент амплифико-

нов, когда их число начнет превышать число молекул Taq-ДНК-полимеразы.

В качестве исходной матрицы для ПЦР может быть использована ДНК, вы-

деленная как из свежеполученных клеток и тканей, так и из замороженных, вы-

сушенных или фиксированных препаратов, имеющих частично деградированные нуклеиновые кислоты, т.е. объекты, ранее недоступные для анализа. Так, с помо-

щью ПЦР была амплифицирована, клонирована и секвенирована ДНК египетской мумии, продемонстрирована возможность анализа специфических участков ДНК при наличии одного волоса, клетки, сперматозоида в целях идентификации лич-

ности и пола хозяина.

Подготовка пробы материала (выделение ДНК и РНК) должна проводиться в условиях, исключающих перекрестное загрязнение исследуемых проб выделяе-

мыми НК. Для исключения ложноположительного результата необходимо обяза-

тельное использование чистых перчаток, одноразовых пробирок и наконечников к автоматическим пипеткам, предварительной ультрафиолетовой обработки поме-

щения и рабочих поверхностей столов и приборов.

134

Можно не только амплифицировать нужную ДНК, но и вносить в нее необхо-

димые изменения. Эта возможность обусловлена тем, что, с одной стороны, прай-

меры физически входят в состав ДНК-продукта, а с другой — последовательность праймера, особенно вблизи его 5'-конца, может отличаться от последовательности ДНК-мишени. Праймер, содержащий на 5'-конце некомплементарный довесок длиной до 45 нуклеотидов, эффективно работает в ПЦР.

ПЦР удобна для изучения и диагностики наследственных и вирусных забо-

леваний, когда серологические тесты или культивирование вируса затруднены или малоэффективны, когда вирус имеет высокую антигенную изменчивость, что осложняет применение иммунологических методов диагностики.

Достоинства ПЦР:

 быстрота анализа. Все процедуры ПЦР занимают 1-2 рабочих дня при па-

раллельной обработке 10-12 образцов;

 надежность анализа. Под этим подразумевается защищенность от ложно-

положительных и ложноотрицательных результатов. При аккуратной работе с об-

разцами и реактивами, при использовании всех контролей, надежного оборудова-

ния и жестко стандартизированных реактивов методы диагностик вирусных ин-

фекций, основанные на ПЦР, являются высоконадежными;

 чувствительность анализа - наименьшая концентрация клеток или вирус-

ных частиц в пробе, дающей положительный результат анализа, и определяется сочетанием следующих 3-х факторов: эффективного выделения НК возбудителя,

чувствительности собственно ПЦР и чувствительности выбранного метода инди-

кации. ПЦР позволяет достичь предельно возможной чувствительности: от не-

скольких копий до одного возбудителя в пробе;

 специфичность анализа 100 % - выявление возбудителей конкретного ви-

да, рода на фоне других вирусов и клеток организма-хозяина.

пригоден любой материал, гистологические препараты;

количество исследуемого материала составляет несколько десятков мик-

ролитров;

 метод позволяет определить число копий возбудителя в пробе и тем са-

135

мым контролировать вирусемию или бактериемию в процессе лечения;

 исследуемый материал может быть дезинфицирован химической или тер-

мической обработкой в момент его забора, и, следовательно, исключается возмож-

ность инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР;

 простота исполнения и возможность полной автоматизации.

ПЦР должна проводиться в изолированной комнате сотрудником, не произ-

водящим обработку клинических образцов и не готовящим реактивы для ПЦР.

Приготовление основных растворов также должно производиться в отдельной чистой комнате. Все растворы должны храниться и использоваться в небольших размерах. Необходимо неуклонно выполнять специальные требования к плани-

ровке и режиму работы ПЦР генодиагностической лаборатории.

Эта реакция успешно используется при диагностике вирусной диареи, чумы,

ИРТ КРС, ящура, чумы свиней, болезни Ауески, болезни Марека, инфекционного бронхита птиц и др.

Перечень контрольных вопросов:

1.Принцип ПЦР.

2.Амплификация,

3.Праймеры.

4.Денатурация.

5.Отжиг.

6.Элонгация.

7.Постановка ПЦР.

8.Учет результатов ПЦР.

9.Задачи, которые можно решить с помощью ПЦР.

10.Достоинства и недостатки ПЦР.

Тема 1.14. Коллоквиум № 2 по серологическим реакциям

Цель: проверить остаточные знания студентов по пройденному материалу

Содержание:

 реакция нейтрализации;

136

реакция диффузной преципитации;

реакция иммунной диффузии;

реакция торможения гемагглютинации;

реакция непрямой гемагглютинации;

метод флуоресцирующих антител;

иммуноферментный анализ;

метод ДНК-зондов;

полимеразная цепная реакция.

РАЗДЕЛ 2. ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ

Тема 2.1. Лабораторная диагностика бешенства

Цель: изучить лабораторные методы диагностики бешенства и биологические особенности возбудителя.

Содержание:

отправка патологического материала в лабораторию;

схема лабораторной диагностики вируса;

РИФ;

ИФА;

ПЦР;

РДП;

выделение вируса in vitro на культурах клеток;

выявление телец Бабеша-Негри;

постановка биологической пробы;

методы прижизненной диагностики бешенства;

дифференциация бешенства от других заболеваний;

некоторые сведения о вирусе бешенства.

137

Отправка патологического материала в ветеринарную лабораторию

В лабораторию нарочным от мелких животных направляют свежие трупы мелких животных целиком предва-

рительно обработанные инсектици-

дами, а от крупных животных от-

правляют голову с двумя первыми шейными позвонками (рисунок 46).

Для постановки биопробы допуска-

ется использовать пробы мозга,

консервированные в 30 % - 50 %

растворе глицерина.

Патологический материал упа-

ковывают в пластмассовые мешки,

вкладывают в плотно закрывающиеся ящики с влагопоглощающей прокладкой,

пропитанной дезинфектантом. Мозг – в банку с притертой стеклянной или рези-

новой пробкой, залитую парафином, или любой другой водонепроницаемый кон-

тейнер. Материал и сопроводительное письмо, в котором указаны отправитель и его адрес, вид животного, анамнестические данные и обоснование подозрения в заболевании животного бешенством, дата и подпись врача, отправляют с нароч-

ным.

Разрез трупа, удаление мозга, отбор проб и их исследования осуществляют при суровом соблюдении мероприятий по личной профилактике – надевают спецодежду, руки защищают двумя парами перчаток (хирургическими и анато-

мическими), глаза закрывают защитными очками, нос и рот прикрывают 6-

пластовой марлевой повязкой, надевают резиновый или полиэтиленовый фартук.

138

Схема лабораторной диагностики вируса бешенства

Методы проведения лабораторной диагностики

Диагноз на бешенство считается установленным при получении одного из следующих по-

казателей:

1.Выявлено при микроскопии в мазках-отпечатках или гистопрепаратах телец Бабеша-

Негри;

2.Обнаружено в нескольких полях зрения микроскопа при исследовании отпечатков с помощью МФА не менее 10 типичных гранул с ярким зеленым свечением. В контроле подобных образований нет;

3.Биопроба ставится, когда в патологическом материале не обнаружены тельца БабешаНегри и получены отрицательные результаты других исследований.

Лабораторная диагностика вируса бешенства включает в себя обнаружение вируса (антигена) в реакции иммунной флюоресценции (РИФ) и реакции диф-

фузной преципитации (РДП), окраску мазков на обнаружение телец Бабеша-

Негри и постановку биологической пробы. Также при диагностике вируса бешен-

ства можно применять и другие серологические реакции, такие как иммунофер-

ментный анализ (ИФА), полимеразная цепная реакция (ПЦР). Сам вирус можно выделить путем культивирования его на культурах клеток. Чаще всего на вирус бешенства проводится посмертная диагностика, но возможно и прижизненная ди-

агностика.

Реакция иммунной флюоресценции (РИФ)

Быстрым и чувствительным методом диагностики бешенства является метод флуоресцирующих антител (МФА), основанный на микроскопическом исследо-

вании в ультрафиолетовых лучах отпечатков, мазков и криоконсервированных срезов тканей, обработанных антирабическим глобулином конъюгированным с флуоресцеин изотиоционатом

Для реакции биологическая промышленность выпускает флуоресцирующий антирабический гамма-глобулин. На обезжиренных предметных стеклах готовят

139

тонкие отпечатки или мазки из различных отделов головного мозга левой и пра-

вой стороны (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок и продолговатый мозг).

Готовят не менее 2 препаратов каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, подчелюстные слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).

ром или фосфатным буфером, споласкивают нейронах при бешенстве. РИФ.

дистиллированной водой, высушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом.

Впрепаратах, содержащих вирус бешенства, наблюдаются разной величины

иформы флуоресцирующие желто-зеленым цветом гранулы в нейронах, но чаще вне клеток (рисунок 47). В контроле подобного свечения не должно быть, нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсив-

ность свечения оценивают в крестах. Отрицательным считают результат при от-

сутствии специфической флуоресценции.

Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя

исследовать в РИФ в течение 3 мес. после прививки, т.к. может быть флуорес-

ценция антигена вакцинного вируса.

В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином,

формалином, спиртом и т.д., а также материал, имеющий признаки даже незначи-

тельного загнивания.

140