2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)

Специфическую активность определяют в реакциях биологической и сероло-

гической нейтрализации. Реакцию биологической нейтрализации ставят на вос-

приимчивых лабораторных животных, эмбрионах птиц или культурах клеток. Для серологического тестирования применяют РН, РДП в агаровом геле, РТГА, РСК,

РНГА и др. с использованием в качестве контроля заведомо известных позитив-

ных и негативных сывороток (референс-препаратов).

Кроме того, проверяют превентивные свойства лечебных и профилактиче-

ских сывороток на восприимчивых животных. Чтобы определить активность сы-

воротки, ее вводят животным внутрибрюшинно, подкожно или внутримышечно.

Затем через 20-24 ч инъецируют подтитрованную дозу вирулентного контрольно-

го штамма соответствующего микроорганизма. Подопытные животные должны оставаться здоровыми не менее 14 дней, контрольные - погибнуть или заболеть.

Сыворотки реконвалесцентов (противовирусные и антибактериальные) полу-

чают от животных, переболевших инфекционной болезнью без осложнений. Сы-

воротку рекомендуют получать и использовать в условиях одного хозяйства.

Кровь от животных-доноров можно брать непосредственно в хозяйстве или на мясокомбинате во время их убоя. Сыворотки реконвалесцентов применяют при парагриппе, вирусной диарее крупного рогатого скота, сальмонеллезе, пастерел-

лезе и т. д.

Лечебные глобулины (против болезни Ауески сельскохозяйственных живот-

ных и пушных зверей, сибирской язвы) представляют собой водный раствор у - и

р-глобулинов сыворотки крови животных. Иммуноглобулины получают различ-

ными методами (риваноловым, спиртовым и путем осаждения сульфатом аммо-

ния) из гипериммунных сывороток.

Бактериофаги - вирусы, которые проникают в бактериальную клетку, раз-

множаются в ней и лизируют ее с выходом фаговых частиц в окружающую среду.

Бактериофаги способны лизировать только определенные микроорганизмы. Вве-

денный в организм бактериофаг сохраняется в нем 5-7 дней (прием бактериофага не может заменить вакцинацию). В нашей стране выпускают бактериофаги про-

тив сальмонеллеза или колибактериоза телят, пуллороза - тифа птиц.

211

Для идентификации возбудителей болезней в бактериальных культурах и свежем патологическом материале биопромышленность выпускает: сибиреязвен-

ный бактериофаг К-ВИЭВ. «Гамма-МВА», ВНИИВВиМ, лиофилизирован-

ные бактериофаги для идентификации возбудителей листериоза, стафилококко-

вые - для типирования штаммов; бруцеллезный бактериофаг.

Диагностические сыворотки используют не только для идентификации воз-

будителя инфекции, но и для определения его типа и варианта. Производство ди-

агностических сывороток строго регламентировано, что обусловливает их высо-

кое качество и стандартность. В большинстве случаев продуцентами названных сывороток служат лабораторные животные (кролики, морские свинки), петухи и редко - лошади.

Глобулин диагностический (для диагностики бешенства в прямом методе иммунолюминесцентной микроскопии) - это чистая γ-глобулина, выделенного из высокоактивной моноспецифической антирабической сыворотки лошадей и хи-

мически вязанного с изотиоцианатом флуоресцина. Аллергены представляют со-

бой фильтрат убитых бактериальных клеток или извлеченных из них активных фракций: туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих, ППД для птиц,

комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ); бруцетин ВИЭВ;

маллеин.

Аллергическая диагностика основана на повышенной специфической чувст-

вительности зараженного организма к определенным аллергенам - веществам бактериального происхождения, введение которых одним из методов (внутри-

кожно, подкожно или на слизистую оболочку глаза) больному животному, осо-

бенно в латентный период, вызывает местную реакцию.

Антигены - это вещества, способные при введении в организм вызывать в нем иммунологические реакции: синтез антител, формирование клеточной гипер-

чувствительности и др. Антиген реагирует с образовавшимися антителами как в живом организме, так и в пробирке.

212

Для серологических реакций выпускают: единый бруцеллезный антиген для РА, РСК и РДСК; бруцеллезный Розбенгал антиген; паратуберкулезный, листери-

озный, сапной, кампилобакте-риозный, лептоспирозный антигены и т. д.

Правила транспортировки биопрепаратов. Поскольку качество биопрепара-

тов снижается и даже полностью теряется при промерзании, под воздействием высокой температуры, повышенной влажности, прямого солнечного света, био-

препараты нужно как транспортировать, так и хранить в соответствующих усло-

виях (очень важно это соблюдать по отношению к живым, особенно жидким, вак-

цинам).

Ветеринарные биопрепараты хранят в сухом темном помещении при темпе-

ратуре 2-10 °С; перевозят всеми видами транспорта в соответствии с правилами перевозки скоропортящихся грузов и багажа. При длительной транспортировке используют закрытые рефрижераторные вагоны (кузова, контейнеры), оснащен-

ные холодильными установками или холодильными камерами при температуре от

2-5 до 8-10 °С. Для каждого препарата оборудуют отдельное место. При этом на-

рушение целостности упаковки и попадание влаги, а также даже однократное за-

мораживание жидких биопрепаратов недопустимы.

Требования, предъявляемые к биологическим препаратам. Биопрепараты выпускают в ампулах и флаконах различного объема. На каждой ампуле или фла-

коне должны быть наклеены этикетки, содержащие следующую информацию:

наименование и местонахождение предприятия-изготовителя;

название препарата;

количество препарата с указанием активности в единицах;

состав препарата, если он поливалентный;

номер серии;

номер государственного контроля;

срок годности препарата и дата его изготовления.

В каждую упаковку вкладывают наставление по применению препарата, ут-

вержденное Департаментом ветеринарии МСХ РФ. Все биопрепараты должны

213

быть изготовлены в соответствии с определенными ГОСТом, ТУ и пройти обяза-

тельный государственный контроль.

Во время транспортировки и хранения препарат может испортиться, поэтому перед применением его обязательно тщательно осматривают.

Препарат непригоден для использования в следующих случаях:

 отсутствует этикетка (надпись на флаконе) или не указан номер серии и

(или) контроля;

отсутствует наставление по применению;

нарушена укупорка флакона, целостность флакона (ампулы, пробирки и

пр.);

промерзла жидкость во флаконе (для жидких препаратов);

изменен обычный внешний вид (цвет, консистенция, запах и т. д.);

в содержимом флакона присутствуют пленки, хлопья, плесень, комочки,

сгустки или осадок, не разбивающийся при встряхивании;

 истек срок годности препарата.

Лиофилизация микроорганизмов

Лиофилизацию микроорганизмов (биологических препаратов) применяют с целью длительного хранения микроорганизмов и биопрепаратов.

Этот метод заключается в обезвоживании биологических объектов при низ-

ких температурах под вакуумом, т. е. вода удаляется из замороженного материала путем испарения льда, минуя жидкую фазу. Лиофилизированные биопрепараты сохраняют длительное время свои первоначальные свойства и легко растворяются в воде.

Лиофильная сушка биопрепаратов включает в себя два этапа:

1.Жидкие биопрепараты, разлитые по ампулам или флаконам, замораживают при температуре от минус 40 до минус 60 °С;

2.Замороженные препараты переносят в сушильную камеру и создают глу-

бокий вакуум.

Ампулы или флаконы быстро запаивают или закупоривают, предварительно

создавая в них вакуум, или заполняют инертным газом. В настоящее время в ве-

214

теринарии применяется большое количество сухих вакцин и других биопрепара-

тов.

Правила использования и хранения биопрепаратов, их транспортировка

Перед использованием упаковки проверяют этикетку и обращают внимание на номера серии и контроля, а также внешний вид препарата. Уточняют правила его использования (по наставлению) и дозировку.

Жидкие препараты, содержащие депонирующие вещества (квасцы, ГОА,

масляный адъювант и т. п.), тщательно встряхивают до получения равномерной взвеси.

При растворении сухих препаратов применяют только указанный в наставле-

нии растворитель (разбавитель). Чаще всего это стерильная дистиллированная во-

да.

Живые вакцины не содержат консервантов, поэтому при их вскрытии необ-

ходимо соблюдать правила антисептики и избегать попадания в препарат дезин-

фицирующих средств.

Вскрытые флаконы должны быть использованы в этот же день. Неиспользо-

ванные препараты утилизируют кипячением.

По истечении срока годности препараты бракуют или отправляют (если ос-

талось много) на повторный контроль во ВГНИИКСС (в этом случае срок годно-

сти может быть продлен).

Биопрепараты выбраковывают комиссионно, составляют акт. Выбракован-

ные препараты утилизируют автоклавированием или кипячением.

Эффективность биологических препаратов во многом зависит от соблюдения правил применения, режима и условий их хранения. В работе с биопрепаратами необходимо действовать в соответствии с рекомендациями и наставлениями по их применению. Соблюдение условий хранения биопрепаратов гарантирует стабиль-

ность иммуногенных свойств, их высокую активность и специфичность. Повы-

шенные требования предъявляют к хранению и транспортировке живых атте-

нуированных вакцин, поскольку разгерметизация флаконов, как правило, приво-

дит к инактивации вакцинных штаммов. Сухие биопрепараты имеют ряд сущест-

215

венных преимуществ, так как они сохраняют свои свойства в довольно широком диапазоне температур.

Вакцины, содержащие в своем составе депонирующие вещества, перед при-

менением необходимо интенсивно взбалтывать до получения равномерной взве-

си.

Эмульгированные вакцины, содержащие минеральные масла, перед введени-

ем необходимо подогреть в водяной бане при температуре 36-37 °С, а затем тща-

тельно взболтать. Совершенно недопустимо замораживание жидких вакцин. Ис-

пользованию подлежат биопрепараты только с не истекшим сроком годности, без наличия хлопьев и различного рода осадков, плесени, помутнения, видимых внешних повреждений флаконов.

При растворении сухих биопрепаратов применяют только указанный в на-

ставлении разбавитель. Живые вакцины, оставшиеся после проведения вакцина-

ции, подлежат уничтожению кипячением.

Все флаконы и ампулы с биопрепаратами должны быть опечатаны и снабже-

ны этикетками, на которых указывают наименование препарата, биофабрику, дату выпуска, срок годности, серию, номер госконтроля, дозировку. Хранят и транс-

портируют прививочные средства при условиях, не влияющих на их внешний вид,

специфические свойства в течение срока годности.

В производственных условиях биопрепараты хранят в холодильных установ-

ках с определенным микроклиматом или на специальных складах (подвалы). По-

мещения (склады) для хранения биопрепаратов должны быть сухими, темными и прохладными, с равномерной в течение всего года температурой 2-15 °С. Для хранения каждого вида препарата должно быть выделено определенное оборудо-

ванное место или отделение (полка, шкаф). Воспрещается совместное хранение годных и выбракованных препаратов. Помещение для хранения препаратов долж-

но быть закрыто, а ключ должен находиться у ответственного лица. Биопрепараты выбраковывают при отсутствии на флаконах этикеток, повреждении упаковки,

просачивании препарата через пробку, промерзании, наличии посторонних при-

месей, плесени, пленок, комочков, гнилостного запаха, изменений установленной

216

консистенции и цвета. Браковку препаратов проводят комиссионно с участием ве-

теринарного врача. Уничтожение забракованных препаратов проводят путем ав-

токлавирования или кипячения при составлении акта.

Транспортировку больших партий биопрепаратов в зимнее время производят в обогреваемых вагонах или на обогреваемых автомашинах.

Перечень контрольных вопросов:

1.Вакцины.

2.Сыворотки.

3.Аллергены.

4.Бактериофаги.

5.Антигены.

6.Лиофилизация биопрепаратов.

Тема 4.2. Диагностические препараты

Цель: изучить свойства биопрепаров.

Содержание:

антигены;

аллергены;

бактериофаги.

Принцип и методика приготовления антигена аналогичны приготовлению инактивированных вакцин.

Антигены, как и другие диагностические препараты, готовят на биофабри-

ках (биокомбинатах). В своем составе они содержат убитые целые микробные клетки или экстракты, полученные из соответствующих микроорганизмов.

В ветеринарии для диагностики инфекционных болезней используют сле-

дующие антигены:

- единый бруцеллезный антиген для РА, РСК (РДСК) - биомасса из вакцин-

ного штамма 19, выращенная на обогащенном печеночном агаре, которую инак-

тивируют нагреванием и устанавливают концентрацию микробных клеток по оп-

тическому стандарту до 10 млрд/мл;

217

- бруцеллезный антиген для кольцевой реакции с молоком (КР) - взвесь уби-

тых нагреванием бруцелл, окрашенных в синий цвет гематоксилином;

- бруцеллезный антиген для РА на стекле (роз-бенгал) - суспензия убитых на-

греванием и фенолом бруцелл, окрашенных бенгальским розовым;

- стандартный сибиреязвенный антиген для РП - экстракт из убитых нагрева-

нием бацилл вирулентного штамма сибирской язвы;

-сальмонеллезные антигены;

-цветной антиген для диагностики пуллороза, тифа птиц и сальмонеллеза водоплавающих птиц;

-антиген листериозный;

-сапной антиген;

-антиген вибриозный (кампилобактериозный);

-антиген для диагностики микоплазмоза птиц в сывороточно-капельной ре-

акции агглютинации;

- антигены для диагностики лептоспироза в реакции макроагглютинации.

Аллергены в качестве диагностических препаратов представляют собой экс-

тракты из бактериальной массы, их выпускают биофабрики (биокомбинаты).

Указанные препараты используют при аллергической диагностике туберку-

леза (туберкулин), паратуберкулеза (паратуберкулин), бруцеллеза (бруцеллин),

сапа (маллеин), туляремии (тулярин), сибирской язвы (антраксин) и др.

Туберкулин готовят путем выращивания культур микобактерий туберкулеза бычьего и человеческого вида на мясопептонном глицериновом бульоне (в тече-

ние 6-8 недель.). Затем культуру стерилизуют в автоклаве, упаривают до 1/10 объ-

ема, отстаивают, фильтруют через бактериальные фильтры (Зейтца) и добавляют

50 % глицерина. Контроль качества аллергена включает в себя установление сте-

рильности и специфической активности, которую проверяют на здоровых и реа-

гирующих на аллерген животных параллельно со стандартным аллергеном.

Бактериофаги обладают способностью проникать в бактериальные клетки,

репродуцироваться в них и вызывать их лизис. Источником фагов патогенных

218

микробов служат больные и переболевшие животные и люди, выделяющие с фе-

калиями фаги во внешнюю среду.

Фаг получают путем добавления в котлы с бульонными бактериальными культурами производственного фага. После выдерживания при 37 °С в течение суток культуры фильтруют. Фильтрат проверяют на чистоту, стерильность, без-

вредность и активность.

Учитывая высокую специфичность действия бактериофагов на гомологичные им организмы, для дифференцирования и индикации некоторых видов бактерий с успехом применяют соответствующие фаги (например, при сибирской язве, пара-

тифозных инфекциях и др.). Разработана фагодиагностика многих инфекционных болезней (бруцеллез, пастереллез, сальмонеллез, колибактериоз и др.), а также фаготерапия и фагопрофилактика.

Фагодиагностику можно использовать при санитарно-бактериологических исследованиях объектов окружающей среды для обнаружения бактериофага в во-

де, почве в качестве показателя их загрязнения соответствующим фагу микробом.

Биологическая промышленность выпускает следующие диагностические бактериофаги: сибиреязвенный, листериозный, бруцеллезный, стафилококковые бактериофаги для типирования штаммов.

Перечень контрольных вопросов:

1.Цели применения диагностических препаратов в ветеринарии.

2.Бактериофаги.

Тема 4.3. Биотехнология изготовления вакцин

Цель: изучить виды вакцин и их особенности.

Содержание:

живые вакцины;

аттенуированные вакцины;

химические вакцины;

анатоксин;

219

Вакцины - средства специфической активной иммунопрофилактики. Выпус-

кают живые, инактивированные, химические вакцины, анатоксины, генноинже-

нерные и др.

Живые вакцины готовят из штаммов микроорганизмов с ослабленной виру-

лентностью (аттенуированные). Главное требование, предъявляемое к вакцинным штаммам, - наличие стойкой наследственно передающейся остаточной вирулент-

ности. При введении таких штаммов микроорганизмов в организм культура должна приживаться и размножаться, но не вызывать клинических проявлений болезни, что приводит к созданию иммунитета высокой напряженности и дли-

тельности.

Вакцинные штаммы получают различными способами:

1. Использование аттенуированных (с ослабленной вирулентностью) штам-

мов, возникших в естественных условиях обитания возбудителей инфекционных болезней.

2. Искусственное получение аттенуированных штаммов возбудителей в ла-

бораторных условиях:

-выращивание возбудителя на искусственных питательных средах;

-перевод возбудителя на другой вид восприимчивого животного;

-перевод возбудителя на невосприимчивый вид животного.

3. Ослабление вакцинных штаммов прямым (непосредственным) воздействи-

ем на ген возбудителя мутагенами физической природы: проникающая радиация,

ультрафиолетовое излучение, пониженная или повышенная температура и др.

4.Комбинированные методы получения вакцинных штаммов в лабораторных условиях.

5.Изменение генома вакцинных штаммов с помощью технологии рекомби-

нантных ДНК.

Для приготовления вакцин аттенуированные штаммы возбудителей культи-

вируют на специальных питательных средах в реакторах, куриных эмбрионах или культурах клеток и тканей. Полученную биомассу очищают от балластов и после

220