1.4.3. Сорбенты для обращенно-фазовой хроматографии

Модифицированными сорбентами с химически привитыми группами, используемыми в ОФХ, являются силикагели, на поверхности которых ковалентно привиты алкильные группы C₂-C₈, C_18, фенильные, алкиламино-, амино-, нитро- и диольные группы (табл. 10).

Наиболее распространенными в практике ОФХ являются октадецильные фазы (С₁₈). Плотность прививки составляет 1.1-2.3 нм^-2. Привитые сорбенты разных производителей отличаются как по типу модификатора, так и по концентрации органического модификатора и концентрации оставшихся после прививки силанольных групп на поверхности силикагеля. Содержание углерода в сорбентах составляет 5-20%. Степень покрытия поверхности силикагеля органическим модификатором обычно составляет 10-60%.

Наличие остаточных силанольных групп приводит к тому, что адсорбционный и ионообменный механизмы удерживания всегда сопутствуют обращенно-фазовому.

Для уменьшения числа силанольных групп сорбенты эндкеппируют (дополнительно обрабатывают триметилхлорсиланом). Размер пор S_p модифицированных сорбентов находится в пределах 150-550 м²/г. Удерживание и селективность сорбентов, не смотря на идентичность модифицирующих групп, варьируют достаточно сильно. Причинами невоспроизводимости являются различия в свойствах исходных силикагелей и условий модифицирования. Недостатками обращенно-фазовых сорбентов на основе силикагеля являются ограниченно допустимый диапазон рН и сорбционная активность остаточных силанольных групп. В результате качественного эндкеппинга и других усовершенствований удается справиться с этим недостатком. Например, обращённо-фазовые колонки Луна С18 фирмы «Феноменекс» обладает стабильностью в диапазоне значений рН 1.5 – 10. Их лишены также полимерные сорбенты PRP-1 (Polymer Reversed Phase) фирмы «Гамильтон». Эти сорбенты представляют собой жесткий стирол-дивинилбензольный гель, S_p=415 м²/г, V_p=0.79 см³/г, d_p=7.5, размер частиц 5,10 мкм. По селективности сорбент аналогичен октадецильным силикагелям.

Таблица 10. Свойства некоторых сорбентов для ОФХ с привитой фазой

Сорбент	Sp, м2/г	dр, нм	d, мкм	Форма частиц
Адсорбосил С8	450	6	5,10	Нерегулярная
Адсорбосил С18	450	6	5,10	Нерегулярная
Адсорбсфер C8	200	8	3,5,10	Сферическая
Адсорбсфер С18	200	8	3,5,10	Сферическая
Аллтима C8	-	10	5,10	Сферическая
Аллтима С18 NUC	-	10	5,10	Сферическая
АльфаБонд С8	300	12.5	5,10	Нерегулярная
АльфаБонд C18	300	12.5	10	Нерегулярная
μ-Бондапак C18	300	10	10	Сферическая
μ-Бондапак Фенил	300	10	10	-//-
Гиперсил ОДС (С18)	170	10	3,5,10	-//-
Зорбакс C8	350	7	8	-//-
Зорбакс ОДС	350	7	8	-//-
Диасорб-130-С1	300-330	11	5,7,10	Нерегулярная
Диасфер-130-С4	300-330	11	5,7,10	Сферическая
Диасфер-130-С8	300-330	11	5,7,10	-//-
Диасфер-130-С18Т	300-330	11	5,7,10	-//-
Диасфер-130-Фенил	300-330	11	5,7,10	-//-
Лихросорб РП-18	300	10	5,7,10	Нерегулярная
Лихросфер РП-18	300	10	5	Сферическая
Луна С18	300		3,5	-//-
Луна С5	100		5	-//-
Луна С8	300		5	-//-
Нуклеосил C18	300	10	3,5,7,10	-//-
РоСил С18	400	8	3,5,8	Сферическая
РоСил C8	400	8	3,5,8	Сферическая
РоСил Фенил	400	8	3,5,8	Сферическая
Сепарон C18	300	10	5,10	Сферическая
Силасорб С8	300	10	5,7,10,15,20	Нерегулярная
Силасорб C18	300	10	5,7,10,15,20	Нерегулярная
Сферисорб ОДС	220	8	5, 10	Сферическая
Сферисорб С8	220	8	5, 10	Сферическая
ТечСил С18	500	6	5,10	Нерегулярная
ТечСил С8	500	6	5,10	Нерегулярная
Эконосил C18	450	6	5,10	Нерегулярная
Эконосил С8	450	6	5,10	Нерегулярная
Эконосфер C18	200	8	5,10	Сферическая
Эконосфер С8	200	8	5,10	Сферическая
Юпитер С5	300		5	-//-
Юпитер С18	300		5,10	-//-

Фирма «Шова Денко» выпускает на основе пористых полимеров сорбенты RS-пак серии D, в частности, DS-613, DE-613, DM-614, также устойчивые при рН=2-12, характеризующиеся полной адсорбционной инертностью и высокой разделяющей способностью. По гидрофобным свойствам сорбент DS-613 аналогичен полимерному сорбенту PRP-1 и силикагелям с октадецильной привитой фазой. Материалы DE-613, ДМ-614 и DC-613 изготавливают на базе полиметилметакрилата, гидрофильного сложного полиэфира и полистирола с гидрофильными заместителями. Они по гидрофобности занимают промежуточное положение между сорбентами с С₈- и NH₂-фазами и могут применяться как в ОФХ, так и в НФХ.

Одной из основных проблем, связанных с эксплуатацией обращённо-фазовых колонок, является невозможность использования 100%-го водного элюента, что затрудняет их применение при разделении высокополярных органических соединений, например, карбоновых кислот или некоторых водорастворимых витаминов. Вода не проникает в поры привитого сорбента, резко уменьшается контакт сорбата с НФ, что ведёт к катастрофическому снижению времён удерживания (рис. 11).

Рис.11. Взаимодействие водно-органического элюента (а) и водного элюента (b) с порами силикагеля С₁₈

В последнее время появились сорбенты для разделения высокополярных соединений в ПФ с высоким содержанием воды. Это сорбенты с полярной вставкой. В них полярные функциональные группы, такие как амидная, карбаматная или эфирная, вводятся в алкильную цепочку привитой НФ как можно ближе к поверхности силикагеля.

Рис. 12. Рабочая поверхность сорбента Синерджи Полар-РП с полярной вставкой в виде эфирной группы и эндкеппированной гидрофильной функциональной группой

Изначально, сорбенты с полярной вставкой использовали с целью дезактивировать взаимодействия остаточных силанольных групп с основными компонентами пробы. Впоследствии была обнаружена способность данного типа колонок к стабильной работе в условиях водных ПФ. Даже при работе на 100% водном элюенте привитая фаза находится в смоченном состоянии, а алкильные цепи сохраняют конформационную подвижность и способность взаимодействовать с компонентами пробы. При этом наблюдается улучшенная селективность по отношению к полярным соединениям. На рис. 12. схематично изображена рабочая поверхность сорбента колонки Синерджи Полар-РП (Феноменекс, США), являющейся характерным представителем колонок с эфирной группой в качестве полярной вставки.

В табл. 11. перечислен ряд марок колонок с сорбентами, содержащими полярные вставки.

Таблица 11. Марки обращённо-фазовых сорбентов с “полярной вставкой” для работы в водных ПФ

Сорбент	Гидрофобная функциональная группа	Полярная вставка
Chromegabond ODS-Pl	C18	Мочевина
Discovery Amide	C18	Амид
HydroBond AQ	-	-
Inertsil Embedded Polar	-	-
Kromasil Amide C8	C8	Амид
Polaris C18- и C8-Ether	C8, C18	Эфир
ProTec	C8, C18	Амид
Quest Advance	C8	Амид
RTF C18	C18	Амид
Stability-BS-C23	C18	Амин
Supelcosil ABZ+	C18	Амид
SymmetryShield RP18	C8, C18	Карбамат
Synergi Polar-RP	Фенил	Эфир
Zorbax Bonus- RP	C14	Амид

Ещё одним типом сорбентов, способных к воспроизводимой работе на 100% водных элюентах, являются сорбенты с полярным эндкэппингом. Отличительной чертой таких сорбентов является использование полярных эндкэппирующих реагентов вместо триметилхлорсиланов, используемых при модификации традиционных обращённо-фазовых сорбентов. Благодаря наличию полярных групп на поверхности сорбента, он смачивается водой и обеспечивает полное взаимодействие с разделяемыми компонентами. Химическая структура полярных эндкэппирующих групп держится производителями в секрете. В табл. 12. приведены марки колонок с применением техники полярного и гидрофильного эндкэппирования.

Таблица 12. Марки обращённо-фазовых колонок с применением техники полярного или гидрофильного эндкэппинга для работы в водных ПФ

Торговая марка	Производитель	Привитая фаза
Alltima AQ	Alltech Associates	C18
Aqua	Phenomenex	C18
Aquasil C18	Thermo Hypersil - Keystone	C18
HydroBond PS	Mac-Mod Analytical	C8, C18
MetaSil AQ	Ansys Technologies	C18
Nucleosil 100-S Nautilus	Macherey-Nagel	C18
Polarity dC18	Waters	C18
ProntoSIL C18 AQ Plus	Bischoff Chromatography	C18
Synergy Hydro RP	Phenomenex	C18

В ряде случаев аналит настолько полярен, что добавление даже 5% органического модификатора в ПФ приводит к выходу данного соединения с удерживанием близким к V_М на обычной колонке С₁₈. Повышение гидрофобности НФ обеспечивает достаточное количество гидрофобных взаимодействий и увеличивает удерживание полярных соединений.

Таблица 1.13. Марки колонок с длинными алкильными цепочками

Марка	Производитель	Функциональная группа
Advantage C30 Altocarb	Analytical Sales and Services	C30
Develosil C30-UG-5	Nomura Chemical	C30
Hicarbosphere	HPLC Technology	C30
MetaChem C30	Ansys Technologies	C30
PrincetonSpher-C27	Princeton Chromatography	C27
ProntoSil C30	Bischoff Chromatography	C30

Колонки с более длинной алкильной цепью (С₂₇ – С₃₀) не только обеспечивают более сильное удерживание полярных и гидрофобных соединений по сравнению с колонками С₁₈, но и обладают большей рН стабильностью за счёт сильного экранирования поверхности силикагеля длинными алкильными цепочками, а главное, они более устойчивы при работе с водными ПФ (табл. 13). Сравнительно новыми селективными НФ являются фторированные фазы (табл.14). Они содержат либо фторированные полностью, или частично алкильные цепи различной длины, либо фенильные группы. Фторированные фенильные НФ содержат, как правило, пентафторфенильную группу, привитую к силикагелю через короткую алкильную группу (чаще пропильную).

Таблица 14. Некоторые фторированные сорбенты для ОФХ

Сорбент	Производитель	Удельная поверхность, м2/г	Размер пор, Å	Химическая структура НФ
Discovery F5 HS	Supelco	-	120	Перфторфенил
Fluophase RP	Thermo Electron	310	100	Перфторгексил
Fluophase WP	-//-	100	300	Перфторгексил
Fluophase PFP	-//-	310	100	Перфторфенил
Fluofix 120E	-//-	-	120	Перфторгексил нелинейный
FluoroSep-RP Phenyl	ES Industries	350	60	Пентафторфенил
FluoroSep-RP Octyl	ES Industries	450	60	Пентафтороктил
FluoroSep-RP Propyl	ES Industries	120	300	Перфторпропил
Сhromega-bond PFP/T	ES Industries	350	60	Пентафторфенилпропил

В основе механизма разделения на фторированных сорбентах лежат стерическое распознавание, перенос заряда и - взаимодействия. Фторированные НФ могут быть использованы для разделения сложных смесей токоферолов или геометрических изомеров каротина.