4.3. Разделение и идентификация таутомерных форм гидрофобных

β-кетоэфиров в условиях нормально-фазовой хроматографии

При изучении ВЭЖХ желтых ЦФК был установлен любопытный факт ‒ один из полупродуктов желтых ЦФК ‒ о-октадецилоксибензоилметилацетат (ОБА) в определенных условиях НФХ демонстрировал раздвоение хроматографических пиков чистого образца, аналогичное явление наблюдали и для некоторых β-кетоанилидов, полученных из данного β-кетоэфира. Оно было интерпретировано как разделение кето- и енольной форм этого соединения [48].

Если кето-енольное равновесие устанавливается достаточно медленно, возможно хроматографическое разделение кето- и енольной форм, так как они различаются по полярности. Так, для енольной формы logР=8.08, а для кетоформы logР=7.88. Рассмотрим хроматографическое поведение ОБА в различных вариантах ВЭЖХ, и определим признаки хроматографического разделения таутомерных форм. Для этих целей используем следующие приемы: 1) препаративное выделение предполагаемых таутомеров и повторное хроматографирование собранных фракций; 2) изменение аналитической длины волны; 3) снятие УФ-спектров веществ, соответствующих отдельным хроматографическим пикам, в остановленном потоке ПФ; 4) изменение полярности ПФ, замена режима НФХ на ОФХ; 5) добавление в ПФ реагентов, катализирующих кето-енольные превращения.

Наглядным подтверждением хроматографического разделения таутомеров стали результаты препаративной ВЭЖХ. В режиме хроматографирования с нормальными фазами первым из колонки вымывается менее полярный енол, вторым – более полярный кетотаутомер. Найдено, что соотношение площадей пиков енольной и кетоформы S_е/S_к при повторном хроматографировании полученных фракций остается таким же, как на хроматограмме исходного образца, если оно проведено по истечении времени, достаточного для установления кето-енольного равновесия (рис. 67). В случае смеси индивидуальных веществ соотношение пиков должно изменяться после препаративного разделения необратимо.

Рис. 67. Хроматограммы, полученные при препаративном разделении таутомеров ОБА (1) и повторном хроматографировании первой (2) и второй (3) фракций, колонка 150х4.6 мм, Ультрасфер Si, 5 мкм, гексан – этанол (98:2), расход 4.5 мл/мин, 254 нм

Изменение аналитической длины волны в УФД приводит к изменению соотношения площадей пиков таутомеров. В ПФ гексан – этанол (98:2) при 254 нм S_е/S_к =0.7; а при 310 нм S_е/S_к =2.8 (рис. 68).

Рис. 68. Соотношение площадей пиков таутомеров ОБА в зависимости от аналитической длины волны при количестве этанола в ПФ гексан - этанол 2 (а), 4 (б) и 10 (в) %. Колонка 150х4.6 мм, Ультрасфер Si, 5 мкм, расход 4.5 мл/мин

Это связано с тем, что области поглощения енольной и кетонной форм различаются. В УФ-спектрах растворов ОБА (рис. 69) имеются интенсивные полосы поглощения при 245-254 и 290-316 нм, положение которых в разных растворителях изменяется мало, а интенсивность значительно. Согласно данным, приведенным в работе [27,48], при 310 нм поглощает свет преимущественно енольная форма β-дикарбонильных соединений, а в области 250 нм наибольший вклад в поглощение вносит кетоформа.

Эти выводы, полученные путем сопоставления спектров поглощения β-дикарбонильных соединений со степенью их енолизации, определенной химическими методами, были проверены на примере ОБА путем непосредственной регистрации УФ-спектров отдельных фракций, соответствующих хроматографическим пикам кето- и енольного таутомеров, в остановленном потоке ПФ фазы (рис. 70). Оказалось, что полосы поглощения как в области 250, так и 300 нм являются составными, однако для кетоформы наиболее интенсивный максимум лежит в области 250 нм, а для енола характерен максимум поглощения в области 280-320 нм, расщепленный на три пика.

	Рис. 69. УФ-спектры свежеприготовленных растворов ЖК9 (1∙10-4 моль/л) в метаноле (1), гексане (2), ТГФ (3), в гексане через 75 мин (4), в гексане через сутки после приготовления раствора (5)
	Рис. 70. УФ-спектры в остановленном потоке кетоформы ОБА в точке а (1); енольной формы в точке б (2) (Новапак С18, ТГФ-вода, 70:30, расход 1 мл/мин) и УФ-спектр неразделенного пика ОБА (3) (μ-Бондапак СN, гексан - ИПС – диэтиламин, 99.4:0.5:0.1, расход 0.4 мл/мин
	Рис. 71. Корреляция содержания енольной формы ОБА от полярности растворителя (по данным ИК- и ПМР-спектрометрии) [49]

Другим характерным для таутомеров признаком, который наблюдали на хроматограммах, является установление кето-енольного равновесия во времени. В НФХ на хроматограммах свежеприготовленного раствора ОБА интенсивность пика енола со временем растет, а кетоформы — падает.

При снятии УФ-спектров через разные промежутки времени после растворения ОБА также заметны изменения интенсивности - поглощение в области 250 нм уменьшается, а в области 300 нм увеличивается и один максимум расщепляется на три (рис. 70). По-видимому, в кристаллическом состоянии ОБА равновесие существенно смещено в сторону кетоформы.

Увеличение доли полярного растворителя в ПФ гексан – этанол с 2 до 10% приводит к уменьшению соотношения S_e/S_K в 2-3.4 раза в зависимости от выбранной длины волны в интервале 254-310 нм. Влияние состава ПФ на соотношение S_e/S_K вызвано тем, что кето-енольное равновесие β-кетоэфиров чувствительно к полярности растворителя. Увеличение полярности, таким образом, смещает равновесие в сторону образования кетоформы.

Действительно, прямое определение содержания таутомеров ОБА в различных растворителях с использованием спектров ПМР и ИК-спектроскопии по соотношению интегральных интенсивностей сигналов, соответствующих кето- и енольной формам, показало, что заметная доля ОБА существует в виде енола (от 6 до 46%), количество которого падает с увеличением полярности растворителя (табл. 61). Между параметром Р_N, характеризующим полярность растворителя, и степенью енолизации ОБА нами установлена тесная корреляция:

С_е=45.8-24.3logP_N, (102)

где с_е — доля енольной формы ОБА, % , R=0.9624, n=20.

Известно, что кето-енольное равновесие является хорошим индикатором полярности среды. Аналогичная корреляция найдена и для кето-енольного равновесия ацетоуксусного эфира С_е=43.9-23.3logP_N, R=0.9564, n=17. Положения равновесий в одинаковых средах для этой пары β-кетоэфиров оказались близки. Свободный член уравнения (102) соответствует, по-видимому, максимальной концентрации енола в гипотетической абсолютно неполярной среде. Уравнение (102) позволяет в первом приближении оценить равновесное содержание енольной формы ОБА в ПФ произвольного состава.

Таким образом, варьируя состав ПФ, можно на порядок изменить соотношение кетон/енол в анализируемой пробе. Наиболее благоприятные условия разделения таутомерных пиков наблюдали в слабополярных ПФ, которые содержали 90-100% гексана и 10-0% модификаторов – ИПС, этанола, диоксана и др. В этих условиях с_е, имеет максимальное значение 35—44% (табл. 62). При более высоких концентрациях модификаторов разделение пиков было либо неудовлетворительно, либо отсутствовало. В режиме ОФХ разделение пиков таутомеров, наоборот, замечено в наиболее полярной ПФ ТГФ – вода с содержанием воды 30—40%. В этом случае первым вымывается более полярный кетотаутомер. На качество разделения таутомеров влияют не только природа ПФ и НФ, но и скорость элюирования, температура. При увеличении скорости потока ПФ уменьшается ширина пиков и увеличивается глубина минимума между пиками енола и кетоформы. Наличие размытой зоны между этими пиками при низкой скорости элюирования можно связать с протеканием кето-енольных превращений в процессе хроматографирования. Повышение температуры колонки до 30 ^оС приводит к заметному ухудшению разделения пиков.

Разделение таутомеров нежелательно для количественного анализа реакционных масс, содержащих ОБА. Определение состава смесей, во-первых, дополнительно осложняется таутомерным раздвоением пиков, во-вторых, соотношение таутомерных пиков легко изменяется при незначительных колебаниях условий проведения анализа.

Таблица 61. Относительное содержание C_e (%) енольной формы ОБА в растворителях разной полярности (с=0.2 моль/л, 25 ^оС)[49]

Растворитель	По данным ПМР	По данным ИКС
Гептан	-	45
Гексан-d14	43±4	48
СCl4	30±3	32
Толуол-d8	16±2	20
Бензол-d6	20±3	19
CDCl3	7±2	7
CD3OD-CHCl3 (1:3)	8±2	-
Ацетон-d6	12±3	-
Пиридин-d5	10±3	11
CD3OD	6±2	-
CD3OD - ДМСО-d6 (1:4)	7±2	-
ДМСО- d6	6±2	-

Таблица 62. Разделение таутомеров ОБА в разных условиях ВЭЖХ

НФ; зернение, мкм; размеры колонки, мм	ПФ, (расход, мл/мин)	Се, %	RS	λ, нм
Силасорб CN; 7.0; 80×2	Гексан (0.2)	44	9.74	260
Силасорб CN; 7,5; 250×4	Гексан - ИПС – триэтиламин, 99.49:0.5:0.05 (2)	43	0	254
Сепарон CN; 7.0; 150х3.3	Гексан - ИПС, 99.8:0.2 (1.0)	43	2.10	290
Ультрасфер Si; 5: 150×4.6	Гексан – этанол, 98:2 (4.5)	41	2.60	254
Сепарон CN; 7.5; 150×3.3	Гексан - ИПС – хлороформ, 91.6:0.4:8.0 (1.0)	36	1.33	290
Ультрасфер Si; 5; 150×х4.6	Гексан – этанол, 90:10 (4.5)	35	0.86	254
Нуклеосил С18; 5; 64×2	Метанол (0.1)	9	0	290
Новапак С185; 150×3.9	ТГФ – вода – ацетонитрил, 52:16:32 (1.0)	6	0	290
Новапак С18; 5; 150×3.9	ТГФ - вода 70:30 (1.0)	6	0.93	290

Наряду с изменением полярности ПФ для нивелирования таутомерного эффекта можно применять добавки к ПФ оснований диэтил- или триэтиламин, которые катализируют процесс таутомеризации. Благодаря резкому возрастанию скорости установления кето-енольного равновесия, хроматографического разделения таутомеров не происходит. Этот прием оказался удобен в тех случаях, когда изменение полярности ПФ ухудшает разделение ОБА с другими компонентами смеси. Например, для разделения смесей ОБА с его промежуточным продуктом – о-октадецилоксибензоилэтилацетатом оптимальные условия следующие: сорбенты Силасорб CN или μ-Бондапак CN в ПФ гексан – ИПС – триэтиламин (или диэтиламин) с содержанием ИПС 0—0.5% и основания 0.05—0.1%.