1.3.2. Строение сорбата и растворимость
В связи с особой важностью растворимости образца в выборе варианта ВЭЖХ, остановимся на ней подробней. Растворимость сорбата – его способность образовывать с тем или иным растворителем истинные растворы. Количественно она характеризуется максимальным количеством вещества, способным раствориться в данном растворителе при определенных температуре и давлении, т. е. концентрацией насыщенного раствора данного вещества в данном растворителе. Наименее полярные органические соединения – углеводороды, их галогенпроизводные, а также кислородсодержащие соединения с большими алифатическими радикалами, как правило, хорошо растворимы в гексане, базовом растворителе для НФХ. Вещества этой группы довольно слабо удерживаются силикагелем, и для их хроматографии потребовались бы абсолютно неполярные ПФ. Однако силикагель медленно уравновешивается такими растворителями, и получить достаточно стабильные величины удерживания непросто. Поэтому для сорбатов этого типа предпочитают ОФХ. В качестве ПФ в этом случае берут растворы, содержащие 0-30% воды в ацетонитриле или метаноле, а для наименее полярных сорбатов (например, триглицеридов, восков, высших полиядерных ароматических углеводородов) – смеси ацетонитрила с хлороформом либо хлористым метиленом. Органические соединения промежуточной полярности и средней гидрофобности растворяются в сложных эфирах, спиртах, хлороформе. Эти вещества имеют в составе молекул функциональные группы, способные к довольно сильному взаимодействию с силанольными группами силикагеля, полярными функциональными группами химически модифицированных силикагелей. ПФ для ЖХ на этих сорбентах содержат 2-50% полярного органического растворителя в смеси с неполярными или малополярными растворителями.
Равновесие между силикагелем и такими растворами устанавливается быстро и оно довольно устойчиво. Поэтому результаты ВЭЖХ в этих условиях, как правило, хорошо воспроизводятся. Разделение на силикагеле селективней по отношению к пространственной структуре сорбатов, в силу чего НФХ предпочтительна, если предстоит разделение изомеров.
Многие полярные (гидрофильные) органические соединения растворимы в воде, поэтому для них обычно используют ОФХ, имеющую целый ряд преимуществ перед НФХ. ПФ содержит 0-50% органического растворителя (метанол, ацетонитрил, ТГФ) в воде. Соединения выходят из колонки в порядке убывания полярности. Если сорбаты ионизированы в водных растворах, с целью улучшения формы пика и воспроизводимости результатов в ПФ добавляют соли, кислоты, буферные растворы для поддержания необходимой ионной силы и рН. Для ионогенных соединений существуют и другие варианты выбора хроматографической системы, например, ионообменная хроматография. Другой режим разделения ионогенных соединений – ион-парная хроматография. Методически суть ее сводится к тому, что в обычную обращенно-фазовую систему добавляют гидрофобные ионы, имеющие заряд, противоположный по знаку заряду разделяемых ионов. Этот прием позволяет получить пики ионогенных соединений почти идеальной формы, что редко достигается при обычной обращенно-фазовой или ионообменной хроматографии соединений данной группы.
Принципы, позволяющие прогнозировать растворимость вещества, разработаны еще недостаточно строго. Растворимость определяется физическим и химическим сродством молекул растворителя и растворяемого вещества, соотношением энергий взаимодействия однородных и разнородных компонентов раствора, характеризуемым, например, с помощью, так называемой, энергии взаимообмена.
Если преобладает взаимодействие разнородных молекул, растворимость относительно велика, а часто и неограниченна; если преобладает взаимодействие одинаковых молекул, растворимость обычно невелика. Как правило, хорошо растворяются друг в друге подобные по физическим и химическим свойствам вещества («подобное растворяется в подобном»). Так, обычно вещества, состоящие из полярных молекул, и вещества с ионным типом связи лучше растворяются в полярных растворителях (вода, спирты, жидкий аммиак), а неполярные вещества — в неполярных растворителях (бензол, хлороформ, сероуглерод). Для предсказания растворимости неэлектролитов широкое распространение получила предложенная Гильдебрандом теория, согласно которой взаимная растворимость веществ возрастает с уменьшением разности их параметров растворимости [18,19]
δ= (Е/V)1/2, (2)
где Е и V – соответственно удельная энергия испарения и мольный объем компонента. Величина δ может быть найдена и по другим характеристикам чистых компонентов, а также по свойствам раствора. Для электролитов не предложено какой-либо общей теории растворимости, известны лишь некоторые эмпирические правила. Так, растворимость многих электролитов возрастает пропорционально кубу εr растворителя; образование кристаллогидратов обычно увеличивает растворимость солей. Лучше растворимы электролиты с большей склонностью к сольватации растворителем.
Поскольку мерой растворимости вещества при данных условиях служит концентрация его насыщенного раствора, численно растворимость может быть выражена теми же способами, что и концентрация, например, процентным отношением массы растворенного вещества к массе насыщенного раствора или числом молей растворенного вещества, содержащимся в 1 л насыщенного раствора. Часто растворимость выражают числом единиц массы исходного вещества, насыщающего при данных условиях 100 единиц массы растворителя. Выраженную этим способом растворимость называют коэффициентом растворимости. Растворимость различных веществ в воде и органических растворителях изменяется в широких пределах. Если в 100 г растворителя растворяется более 10 г вещества, то такое вещество принято называть хорошо растворимым (ХР); если растворяется менее 1 г вещества – малорастворимым (МР) и практически нерастворимым (НР) считается вещество, если в раствор переходит менее 0.01 г вещества.
Растворение большинства твердых тел сопровождается поглощением теплоты. Это объясняется затратой значительного количества энергии на разрушение кристаллической решетки твердого тела.
Прилагая принцип Ле Шателье к равновесию между веществом в кристаллическом состоянии и его насыщенным раствором, приходим к выводу, что в тех случаях, когда вещество растворяется с поглощением энергии повышение температуры должно приводить к увеличению его растворимости. Повышение температуры используют в ЖХ для плохо растворимых при комнатной температуре веществ с целью повышения эффективности разделения, снижения риска механического засорения хроматографического тракта из-за плохой растворимости сорбата и необратимой сорбции на сорбенте.
Информацию о растворимости органических веществ в растворителях можно почерпнуть в справочной литературе, например [20-23]. Если она малодоступна, то для целей ВЭЖХ достаточно оперативного качественного определения растворимости.
Рис. 6. Выбор условий ВЭЖХ с учетом гидрофобности аналита
Рис. 7. Выбор варианта ВЭЖХ для разделения полимеров
Рис. 8. Принципиальная схема выбора оптимальных условий разделения методом ВЭЖХ, основанная на гидрофобности (полярности) аналита и его растворимости в гидрофильных, универсальных и гидрофобных растворителях
Так, для качественного определения растворимости автором данной книги применялась следующая методика: в бюкс вносят ≈0.02 г вещества, 2 мл растворителя и перемешивают пробу. Если вещество не растворилось при комнатной температуре, нагревают бюкс на водяной бане. По итогам наблюдений можно сделать заключение: а) образец хорошо растворим; б) мало растворим (растворим только при нагревании); в) практически нерастворим. В алгоритм подбора условий ВЭЖХ целесообразно включать такое качественное определение растворимости аналита в 10 растворителях: воде, гексане, метаноле, ацетонитриле, этанолe, ИПС, ТГФ, этилацетате, хлороформе и диоксане. Эти растворители можно разбить на гидрофильные (совместимые с водой), гидрофобные (липофильные, совместимые с гексаном) и универсальные (совместимые и с водой, и с гексаном).
К первым можно отнести ацетонитрил и спирты, ко вторым – хлороформ, этилацетат, к последним – ИПС, ТГФ, диоксан. На рис 6,7 приведены 2 типичные схемы выбора варианта ВЭЖХ, исходя из растворимости сорбата в воде и органических растворителях.
На рис. 8 приведен алгоритм выбора условий ВЭЖХ, в котором учитываются критерии гидрофобности анализируемого сорбата (аналита). На первом этапе рассчитывается критерий гидрофобности аналитов (Н или logP), далее из базы данных, созданной в табличном процессоре, извлекают выборку условий ВЭЖХ соединений с такими же или близкими значениями критериев гидрофобности, исходя из принципа «подобное хроматографировать в подобных условиях». Затем экспериментально на качественном уровне находят растворимость аналитов в 10 типовых растворителях и делают выбор между ОФХ и НФХ.
По данным об оптических (электрохимических и др.) свойствах аналита выбирают условия детектирования. Исходя из эмпирических данных о параметрах удерживания аналитов от полярности ПФ, выбирают первоначальный состав ПФ, после чего экспериментально оптимизируют селективность или эффективность разделения.
На этом этапе возможно использование программ, симулирующих хроматографические системы, например, широко известную программу HPLC DryLab, которая позволяет прогнозировать с достаточно хорошей вероятностью селективность разделения в выбранном варианте системы сорбат – сорбент – элюент по ограниченному набору экспериментальных параметров удерживания аналитов, входящих в состав анализируемой пробы [24].
Применение данного алгоритма на практике позволяет заметно сократить время и реактивы для получения надежной хроматографической методики. Такого рода алгоритм, сопряженный с базами данных и с симулятором ВЭЖХ типа HPLC DryLab и аналогичных ему, можно рассматривать как эффективную экспертную систему для ВЭЖХ.
Таким образом, критерии гидрофобности Н, logP или ClogP и μ (как вспомогательный параметр) являются ключевыми критериями, характеризующими сорбат в первичном отборе условий ЖХ. Применение критериев гидрофобности (полярности) сорбатов по принципу «подобное хроматографировать в подобных условиях» является вариантом широкого обобщения, в котором, конечно, найдется много исключений. Однако этот принцип позволяет сразу отсечь заведомо неблагоприятные условия анализа.