4.5. Обращенно-фазовая хроматография некоторых гликозидов

В биотехнологии актуальной проблемой является обеспечение оперативного контроля гидрофильных водорастворимых органических веществ (углеводов, гликозидов, полифенолов) на разных стадиях технологического процесса. Моно-, ди-, полисахариды с числом остатков моноз равным 3-5, гликозиды и агликоны антоцианидинов, полифенолы разделяются в режиме ОФХ. Гидрофобность моно-, ди- и трисахаридов находится в диапазоне Н=-3.4-2.0, а величина logP варьирует от -2.4 до -5.9, причем с увеличением числа остатков моноз Н постепенно возрастает за счет относительного увеличения атомов С, а величина logP, наоборот, уменьшается обратно пропорционально степени гидроксилирования соединения. Аналогичная ситуация наблюдается у антоциановых красителей. Агликоны имеют Н=4.4-5.2 (logP=0.9-1.6). Для моногликозидов Н=7.1-7.7, logP изменяется от -0.7 до -0.2, а для бигликозидов Н=10-12, logP изменяется от -1.1 до -1.9. Причем расчеты логарифма распределения между октан-1-олом и водой предпочтительней вести по алгоритму BioByte [1], т.е. рассчитывать СlogP, так как есть программные ограничения расчета logP для бигликозидов антоцианов.

Одной из проблем, возникающих в ВЭЖХ углеводов, является отсутствие хромофорных групп, что ограничивает возможности применения УФД, требуется дериватизация, либо применение косвенного детектирования, использование особо чистых растворителей в качестве ПФ, или применения универсального, но менее чувствительного детектора – РМД, или наоборот, селективного амперометрического детектора.

Рассмотрим подбор условий ОФХ гликозидов на примере анализа экстрактов стевиозида в присутствии глюкозы и сахарозы. Ниже приведена формула стевиозида (R₁ – остаток бигликозида β-D-сафорозил, R₂- остаток глюкозы):

Как видно из формулы, это полифункциональное соединение с повышенной гидрофильностью за счет одного моногликозидного и одного бигликозидного остатков. Этот пищевой подсластитель хорошо растворим в полярных растворителях. Углеводы анализируют на специальных колонках, но для этих целей подходят и аминопропильные НФ, обеспечивающие реализацию как нормально-фазного, так и сольвофобного механизмов удерживания углеводов. Поэтому для разделения использовали колонки Луна NH₂ (250×4.6мм, 5 мкм) при 50^оС. В качестве ПФ применяли смесь деионизованной воды (А) и ацетонитрила (В) в градиентном режиме. Программа градиента: 87-82.5% В за 12 мин, 82.5-79% В за 8 мин, 5% В ‒ 5мин, 5% В-87% В за 1 мин, 87% В – 3 мин. Объёмная скорость: 1.5мл/мин. λ=210 нм (рис. 78). Преимущество данной методики – упрощенная пробоподготовка без дериватизации. При пробоподготовке применили фильтры твердофазной экстракции Страта NH₂ для удаления механических примесей и полисахаридов. Недостаток методики – сравнительно дорогая хроматографическая система с градиентным режимом, дорогая колонка с тщательно эндкеппированным сорбентом, применение особо чистого ацетонитрила.

Рис. 78. Хроматограмма водного экстракта стевиозида из листьев стевии

Еще одним классом гидрофильных соединений, которые можно отнести к гликозидам, являются антоциановые красители. Ниже дан пример красителя:

Источником антоциановых красителей является растительное сырье, в том числе и отходы его переработки. Антоциановые пигменты содержат шесть типов агликонов (антоцианидинов) – пеларгонидин, цианидин, дельфинидин, мальвидин, пеонидин и петунидин и существуют в виде смеси разнообразных гликозидов.

Антоциановые красители можно детектировать при помощи СФД в видимой области спектра ‒ при 520 нм, а также при использовании УФД в области поглощения фенольных групп (254-290 нм). Одним из подходящих режимов ОФ ВЭЖХ, испытанных авторами, является анализ экстрактов антоциановых пигментов с помощью микроколоночной ОФХ на приборе “Милихром-4”, колонка 2×80 мм, сорбент Силасорб С₁₈, размер частиц 7 мкм, ПФ ацетонитрил – вода – уксусная кислота (2:8:0.05). Расход элюента – 80 мкл/мин, оптическая длина волны  = 280 нм. Однако полного разделения компонентов в этом режиме не происходит, можно говорить только о разделении их на определенные фракции, для эффективного разделения необходимо применять градиентный режим на колонках длиной 15-25 см [27].

В условиях ОФХ на октадецильных колонках времена удерживания агликонов (антоцианидинов) и гликозидов антоцианидинов зависят от степени гидроксилирования, чем она выше, тем меньше время удерживания T_R. Как сказано выше, для полярных соединений характерны низкие или отрицательные значения ClogP. В первом приближении, T_R обратно пропорционально полярности антоцианов. Такой характер удерживания полностью согласуется с представлениями о его сольвофобном механизме, когда гидробофные соединения вытесняются из свободного объема ПФ к гидрофобной неподвижной привитой фазе C₁₈. Что касается молекулярной массы М, то при одинаковом количестве полярных групп дольше удерживается соединение с большей М. На рис. 79 приведена в качестве примера корреляция между временами удерживания и ГГБ антоцианов (СlogP) в экстрактах черной смородины.

Рис. 79. Отнесение TR пиков к СlogP компонентов смеси антоцианов черной смородины. TR=3.85+1.32СlogP, R=0.954 [27]

Таким образом, смеси гликозидов и гидрофильных агликонов можно контролировать в режиме ОФХ с применением СФД или УФД, предпочтение следует отдавать градиентному элюированию.