Глава 4. Общие закономерности удерживания сорбатов

Закономерности удерживания моно- и полифункциональных органических соединений изучены достаточно хорошо [1-4,12-14, 27,44-45]. В главе приведены некоторые обобщения и наблюдения авторов, не претендующие на истину в последней инстанции, но являющихся полезными в каждодневной практике оптимизации методик ВЭЖХ.

4.1. Нормально-фазовая система сорбат – элюент – сорбент

Молекулярные основы НФХ ароматических соединений, и в частности, фенолов различного строения сформулированы в классических работах Киселевым и Яшина [44,45]. Выявлены следующие основные закономерности НФХ. Удерживание возрастает: а) с увеличением полярности сорбата; б) с уменьшением числа атомов углерода в молекуле сорбата; в) по мере уплощения молекулы сорбата и при увеличении числа -электронов (для полиядерных соединений). Удерживание уменьшается: а) с увеличением степени экранирования полярных (например, гидроксила и аминогруппы) функциональных групп орто-заместителями; б) при увеличении полярности ПФ; в) по мере дегидроксилирования поверхности адсорбента.

В [27] показано, что между гидрофобностью адсорбатов и параметрами удерживания, а также между параметрами удерживания и концентрацией полярного модификатора прослеживаются монотонные нелинейные или линейные в полулогарифмических или логарифмических координатах зависимости:

lоgA=p+mB, (94)

lоgA=a+blgC, (95)

где A – фактор, объем или время удерживания; B – число атомов углерода или критерий гидрофобности, С – концентрация модификатора, параметр полярности или элюирующей способности ПФ.

Для сопоставления гидрофобности соединений, не являющихся гомологами, использовали критерии гидрофобности Шатца Н и Ганча – Лео (logP или ClogP). Для оценки полярности ПФ применили обобщенные критерии полярности Р или P_N . Анализ литературных и собственных данных в [27] показал, что в нормально-фазовой ВЭЖХ высокогидрофобных соединений (Н=18-42) разного строения для приведенных выше зависимостей (94) и (95) коэффициенты корреляции низки, а благоприятные условия хроматографирования высокогидрофобных соединений зачастую лимитируется их растворимостью в ПФ и ее полярностью. Оптимальные ПФ имеют, как правило, повышенное содержание модификаторов средней полярности (до 20 об. %). Например, если определить суммарную полярность Р^о таких ПФ по аддитивному уравнению, она составит диапазон значений 0.024-0.047. В условиях НФХ, рекомендованных в [27] хроматографирования высокогидрофобных веществ, большую роль играет, наряду с адсорбционным, распределительный механизм разделения. При этом разительных отличий между параметрами удерживания соединений с Н, близким к 20 и, например, к 40, не наблюдали.

Не лишен смысла при выборе исходных условий для разработки хроматографических методик статистический подход - "подобное хроматографировать в подобных условиях", избегая экстраполяции в область заведомо неоптимальных решений, однако такой подход не позволяет определить зависимости параметров удерживания от строения сорбатов или состава ПФ в широком диапазоне варьирования. Вместе с тем для выявления особенностей хроматографических свойств сорбатов, как показано в работе [46] представляется интересным провести количественные исследования такого рода.

На рис. 63 в координатах V_R-P° отложена база данных из 778 экспериментальных точек, полученных для 21 соединения, критерий гидрофобности Н которых варьирует от 1.3 до 62.1, а logP=(-0.9-13).

Рис. 63. Влияние полярности ПФ на V_R (мкл) фенолов. Линия А – тенденция для низших фенолов в ПФ с модификаторами VI и VIII группы селективности. Линия В ‒ тенденция для высокогидрофобных фенолов в ПФ с модификаторами II группы [27]

На рис. 64 и 65 показаны тенденции изменения объема удерживания соединений от их гидрофобности в 2-х сериях изоэлюотропных ПФ. В этих и других других сериях наблюдаются тенденции: V_R низгогидрообных сорбатов, в частности, низших фенолов (Н < 12) уменьшаются с увеличением их гидрофобности тем резче, чем полярней ПФ, при гидрофобности Н > 12 удерживание орто-замещенных фенолов слабо зависит от этого параметра. В целом, при отсутствии модификатора или при низких его концентрациях разброс по величине объемов удерживания составляет несколько порядков. С увеличением полярности ПФ до Р^о = 0.02-0.03 разница в параметрах удерживания у низкомолекулярных и высокомолекулярных фенолов резко уменьшается. Дальнейшее увеличение полярности приводит к сокращению объемов удерживания всех рассматриваемых соединений, которые стремятся к величине V_K слабосорбируемого бензола.

Рис. 64. Влияние гидрофобности сорбатов (соединений фенольного типа) на их объемы удерживания в изоэлюотропных ПФ, имеющих Р^о=0.022. Линия А – тенденция для ПФ с модификаторами VI и VIII группы селективности. Линия В – тенденция для ПФ с модификаторами II группы селективности [27]

Рис. 65. Влияние гидрофобности сорбатов (соединений фенольного типа) на их объемы удерживания в изоэлюотропных ПФ, имеющих Р^о=0.027 [27]

Рис. 63-65 наглядно демонстрируют, что разделение низко- и высокогидрофобных сорбатов с увеличением концентрации модификаторов ухудшается, а область оптимальной полярности ПФ, при которой можно добиваться удовлетворительного разделения, манипулируя селективностью модификаторов, лежит в пределах Р^о=0.024-0.04. При этом добавка к разбавителю ИПС или этанола приводит к наиболее резкому уменьшению параметров удерживания аналитов. Так, уже при φ₂= 0.001 увеличение гидрофобности соединения на один порядок, уменьшает объем удерживания также на порядок. Добавка этилацетата, диоксана и хлороформа менее эффективна. Объемы удерживания в ПФ с этими модификаторами стремятся к линии А, а ПФ со спиртами - к линии В (рис. 63-65). Трехкомпонентные ПФ, в которых к слабополярному модификатору типа этилацетата или диоксана добавлен ИПС (φ₃ = 0.001), дают средние значения V_R. В то же время эта добавка весьма полезна, так как в отсутствие спирта, например, низкомолекулярные фенолы элюируются в виде размытого пика, особенно в ПФ, содержащих хлороформ.

Таким образом, с точки зрения структуры сорбата, то ближе к линиям А лежат значения малогидрофобных сорбатов, а к линиям В группируются V_R высокогидрофобных соединений. Величины V_R соединений с Н > 12 при Р^о ≥ 0.027 становятся близкими. При элюировании чистыми разбавителями адсорбированные низкомолекулярные сорбаты вымываются из колонки крайне медленно (V_R>2500 мкл), потому что их удерживание обусловлено в первую очередь водородной связью с силанольными группами поверхности силикагеля. Дополнительный вклад в удерживание, к примеру, 2-нафтола, обратный гидрофобному влиянию, вносит плоская структура с увеличенным числом π-электронов. Умеренно гидрофобные соединения элюируются достаточно быстро, особенно те, которые имеют в opтo-положении карбоксильные, гидроксильные и другие заместители, которые за счет внутримолекулярной водородной связи могут эффективно экранировать фенольную ОН-группу. Из-за сильного экранирующего эффекта внутримолекулярной водородной связи они имеют такие же параметры удерживания, как и высокогидрофобные фенолы с объемными алкильными заместителями. В целом, для соединений у которых специфические взаимодействия существенно ослаблены гидрофобными и (или) внутримолекулярно координированными орто-заместителями в условиях НФХ наблюдается слабое удерживание. Для производных фенола важным является не только доступность ОН-группы, но и параллельная ориентация ароматических колец к поверхности силикагеля [27]. Чем более плоской является молекула, чем доступней ее сорбционно-активные фрагменты для взаимодействия с поверхностью адсорбента, тем сильнее удерживание. Вероятно, с ослаблением специфической адсорбции полярной группы возрастает роль ориентационной составляющей, которая определяется стереохимическими особенностями хроматографируемого сорбата. Например, разделение фуллеренов (Н = 60-94) происходит не по числу атомов углерода, а по ориентации той или иной структуры к поверхности адсорбента. Если эти структуры одинаковы, тогда и времена удерживания фуллеренов равны. Если соединение способно адсорбироваться только одним из нескольких полярных фрагментов, размеры гидрофобного "поплавка" и наличие в нем того или иного числа полярных групп играют второстепенную роль [27]. Так, гидрофобные гомологи алкиламидов 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты с алкильными радикалами С₁₄-С₂₀ не разделяются в условиях НФХ. Известен пример монотонно убывающего влияния числа атомов углерода на параметры удерживания для гомологов фталатов при хроматографировании на силикагеле в ПФ гексан – ИПС (99.9:0.1). Время удерживания гидрофобных гомологов, отличающихся друг от друга на 8 метиленовых групп и имеющих Н=22 и 14, оказались близки, существенно различалось удерживание только между высшими и низшими гомологами и между первыми членами гомологического ряда фталатов. Такая же тенденция наблюдается и в случае фенольных сорбатов – низшие фенолы заметно сильнее удерживаются, чем высшие, причем при возрастании полярности ПФ разница в величинах удерживания резко уменьшается.

Компьютерная обработка полученных в [27] данных показала, что зависимости типа V_R =f(P^о) адекватно описываются рациональными функциями:

V_R=(a+bР)/[1+cР+d(Р)²] . (96).

Интерполяцией из зависимости (96), выявленной экспериментально для конкретного сорбата можно установить его удерживание при любой промежуточной концентрации модификатора и оптимизировать эффективность и селективность разделения двух или более сорбатов, используя стандартные методы планирования эксперимента. С другой стороны, проанализировав полученную базу данных, можно прийти к выводу о принципиальной возможности с помощью какой-либо программы построения кривых (например, SigmaPlot или Microcal Origin) по 3-4 экспериментальным точкам находить зависимость V_R от полярности ПФ по характерной функции (96), что позволяет сократить количество эксперимента при оптимизации состава ПФ. В работе [27] рекомендовано измерения проводить при Р^о, равном 0.012-0.020, 0.022-0.025 и 0.075-0.10, что соответствует φ₂, равной 0-0.005, 0.01-0.02 и 0.1-0.2.

Найдено одно близкое по точности описания экспериментальных кривых уравнение. Компьютерная экспертиза функций V_R=f(P_N), полученных в условиях микровколоночной ВЭЖХ на приборе «Милихром» показала, что они адекватно описываются уравнением инверсии 3-го порядка [27]:

V_R = V₀+a₁/P_N +b₁/(P_N)²+ c₁/(P_N)³ , (97)

где V₀ , a_1, b₁ и c₁– эмпирические коэффициенты. Величина V₀ стремится к минимальному значению, находящемуся в интервале между экстраполируемым объемом удерживания при φ₂ =1 и мертвым объемом. Пусть V₀=160 мкл, что соответствует V_R слабо сорбируемого бензола на нормально-фазовой микроколонке производства «Научприбор» в элюенте гексан – ИПС (φ₂ =0.3, P_N =11.61). Хорошо аппроксимирует начальную область зависимости V_R =f(P_N) в интервале φ₂ =0.001-0.10 уравнение инверсии 2-го порядка, систематически отклоняясь от эксперимента в области, в которой обычно не проводят хроматографирование в связи с низкой селективностью (φ₂>0.2). Т.е. зачастую при описании экспериментальных кривых можно использовать уравнение (98):

V_R = V₀+a₂/P_N +b₂/(P_N)² (98)

Следует отметить, что при оптимизации коэффициентов рациональной функции (96) возможны артефакты в виде резких всплесков значений функции при критических соотношениях знаменателя и числителя, поэтому добиться полной автоматизации при нахождении коэффициентов не удается, требуются дополнительные итерации с целенаправленным вмешательством оператора. В этом отношении регрессии (97) и (98) более удобны для математического описания функций удерживания сорбатов от полярности элюента, хотя и несколько менее точны, чем (96) при описании эксперимента.

Если сопоставлять данные по удерживанию аналита только в одной серии ПФ разбавитель – модификатор, где меняется только концентрации компонентов для прогноза удерживания можно использовать выражение (99), точность аппроксимации этой моделью экспериментальных данных [27] была весьма высока ( R>0.99).

V_R=V₀+a/φ₂ +b/(φ₂)² (99)

Влияние гидрофобности на V_R в НФХ также можно описать уравнениями инверсии (100) и (101), однако из-за наличия минорных факторов точность прогноза не высока (рис. 66):

V_R =а+b/Н+c/Н²+ d/Н³, (100)

V_R =а+b/(logP)+c/(logP)²+ d/(logP)³ (101)

Вместе с тем, они качественно характеризуют быстрый эффект падения V_R при повышении гидрофобности до Н=10-12 (logP=2-3) и слабое влияние гидрофобности на V_R при дальнейшем росте ее величины.

Рис.66. Описание влияния Н на V_R фенолов уравнением (100) в системе сорбат – изооктан – ИПС (99:1) – Силасорб 600

Для улучшения селективности хроматографической системы можно использовать концепцию изоэлюотропных составов, формируя тройные ПФ гексан – диоксан – ИПС или гексан – этилацетат – ИПС, изоэлюотропные бинарным ПФ гексан - ИПС и гексан – этилацетат (диоксан). Хроматографические системы с трехкомпонентными ПФ показали себя эффективней, чем с бинарными ПФ, содержащими модификаторы VI группы, селективность их выше селективности систем с бинарными спиртосодержащими ПФ. Небольшая добавка спирта уменьшает размывание пиков низших фенолов, ароматических аминов, этилацетат и диоксан улучшают растворимость рассматриваемых соединений в ПФ.

Сопоставление данных, полученных на микроколонках, с литературными данными по удерживанию аналогичных сорбатов на стандартных колонках позволило обнаружить смещение диапазона оптимальной полярности ПФ в сторону ее уменьшения. Это факт можно отнести к особенностям микроколоночной НФХ. Микроколонки имеют, в отличие от стандартных колонок, в 20 раз меньший объем адсорбента при уменьшении длины колонки в 3-5 раз, диаметра колонки в 2-2.5 раза, а размеров частиц в 1,5-2 раза. Для микроколоночной ВЭЖХ характерна также в несколько раз меньшая объемная скорость потока элюента и сравнительно низкое рабочее давление. При такой трансформации колонки должны измениться линейная скорость потока, соотношение вкладов вихревой и продольной диффузии, внешней и внутренней диффузии, кинетика адсорбции и десорбции, скорость массообмена в подвижной и неподвижной фазах. Как известно, эффективность колонки тем выше, чем длиннее колонка и меньше ее диаметр, чем выше линейная скорость потока элюента и меньше размер зерен адсорбента. Размеры микроколонок обеспечивают в идеальном случае эффективность в 4000-5000 т.т., что на 20-33% ниже, чем для стандартных колонок.