107-15

-ИФА;

-иммуноблоттинга;

-иммунной электронной микроскопии (ИЭМ).

Дополнительный материал к занятию

Реакции иммунитета с использованием меченых антигенов и антител основаны на том, что один из ингредиентов, участвующих в реакции (антигены или антитела), соединяют с какой-либо меткой, которую легко можно обнаружить. В качестве метки используют флюорохромы (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электронноплотные соединения (ИЭМ).

Иммуноферментный анализ (ИФА), как и другие реакции иммунитета, используется: 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворотке крови с помощью известного антигена. Особенность реакции в том, что известный ингредиент реакции соединён с ферментом (например, пероксидазой). Присутствие фермента определяют с помощью субстрата, который при действии фермента расщепляется и среда окрашивается. Наиболее широко применяется твёрдофазный ИФА.

1.Обнаружение антигена. Первый этап - адсорбция специфических антител на твёрдой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей. Второй этап - добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого лунки промывают. Третий этап - добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченые ферментом. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, если в исследуемом материале имеются антигены, на поверхности твёрдой фазы образуется комплекс антитела-антиген-антитела, меченные ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы

субстратом служит ортофенилендиамин в смеси с Н2О2 в буферном растворе. Под действием фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску.

2.Обнаружение антител. Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках лунок. Обычно в коммерческих тест-системах антигены уже адсорбированы на поверхности лунок. Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антигенантитело. Третий этап - после отмывания в лунки добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против человеческих глобулинов), меченые ферментом. Результаты реакции оценивают, как указано выше.

В качестве контролей используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные, которые имеются в коммерческих системах.

ИФА применяется при многих инфекционных заболеваниях, в частности, при ВИЧ-инфекции, при вирусных гепатитах.

Иммуноблоттинг - это разновидность ИФА (сочетание электрофореза и ИФА). Методом электрофореза в геле разделяют биополимеры, например, антигены вируса иммунодефицита человека. Затем переносят разделённые

71

молекулы на поверхность нитроцеллюлозы в том же порядке, в каком они находились в геле. Процесс переноса называется блоттинг, а полученный отпечаток - блот (англ. blot - пятно). На этот отпечаток действуют исследуемой сывороткой. Затем добавляют сыворотку против глобулинов человека, меченую пероксидазой, затем субстрат, который под действием фермента расщепляется и среда приобретает коричневый цвет. Образуются коричневые полосы в тех местах, где антитела соединились с антигенами. Метод позволяет обнаружить антитела к отдельным антигенам вируса.

Радиоиммунный анализ (РИА). Метод позволяет определить количество антигена в исследуемой пробе. Сначала к иммунной сыворотке присоединяют материал, предположительно содержащий антиген, затем - известный антиген, меченый радиоизотопом, например, I125. В результате происходит связывание определяемого (немеченого) и известного меченого антигена с ограниченным количеством антител. Так как меченый антиген добавляется в определённой дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая осталась свободной из-за конкуренции с немеченым антигеном и была удалена. Количество меченого антигена, связавшегося с антителами, определяют с помощью счётчика. Оно обратно пропорционально количеству определяемого антигена.

Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ). К антигену, например, к вирусу гриппа, присоединяется специфическая антисыворотка, меченая электроноплотным веществом. В качестве метки применяют металлосодержащие белки (ферритин, гемоцианин) или коллоидное золото. При микроскопии в электронном микроскопе делают фотографии, на которых видны вирионы гриппа с присоединившимися к ним тёмными точками - молекулами меченых антител.

Контрольные вопросы

Реакция иммунного гемолиза: необходимые ингредиенты, методика постановки, контроли, практическое применение. Реакция связывания комплемента (РСК): принцип РСК; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии? Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? С помощью какой реакции можно определить, что произошло с комплементом; почему используется именно эта реакция? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает - положительный или отрицательный результат? Методика постановки РСК. Почему исследуемую сыворотку надо инактивировать? Для чего необходимо определение титра и рабочей дозы комплемента? Что произойдёт, если в реакции будет избыток комплемента или недостаточное количество его? Гемолитическая сыворотка: что содержит, как её получают, что такое титр и как его определяют? Комплемент: химическая природа, отношение к высокой температуре, где содержится? Как можно разрушить комплемент? Что практически применяется в качестве комплемента? Каким способом

72

обрабатывают комплемент для получения препарата с длительным сроком хранения? При постановке каких реакций иммунитета (из перечисленных) необходимо добавлять комплемент: реакция нейтрализации токсина антитоксином, реакция преципитации, реакция агглютинации, реакция иммунного бактериолиза, реакция иммунного гемолиза, РСК? Реакция иммунофлюоресценции (РИФ): принцип реакции; укажите последовательность процессов при прямой реакции Кунса; необходимые ингредиенты; что является антигеном, что - антителами, чем помечены антитела; как учитывается результат реакции, с помощью какого микроскопа; как выглядит положительный результат; практическое применение - что можно обнаружить с помощью этой реакции? Непрямая реакция иммунофлюоресценции - укажите последовательность событий при этой реакции; преимущество по сравнению с прямой РИФ. Иммуноферментный анализ (ИФА) - принцип реакции; укажите последовательность событий при постановке реакции с целью обнаружения антигена в исследуемом материале; то же - при обнаружении антител. Иммуноблоттинг - принцип реакции, основные этапы; как учитывается результат; преимущества реакции по сравнению с ИФА. Радиоиммунный анализ (РИА) - основные этапы реакции, какие сыворотки применяются, чем они помечены, как учитывается результат? Иммунная электронная микроскопия - принцип метода; основные этапы; какая сыворотка применяется, чем она помечена; как учитывается результат реакции?

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Заполните таблицу в рабочей тетради: «Реакции иммунитета»

Работа студента на практическом занятии

1.Учтите готовый результат РСК, заполните таблицу в рабочей тетради и сделайте вывод. Разберите диагностические препараты, необходимые для РСК.

2.Реакция иммунофлюоресценции. Составьте в тетради схему постановки РИФ. Посмотрите диагностические препараты; определите - что содержит сыворотка, как приготовлена, для какой реакции (прямой или непрямой РИФ) она применяется. Посмотрите результат РИФ в люминесцентном микроскопе.

3.Иммуноферментный анализ (ИФА). Составьте в тетради схему постановки реакции. Ознакомьтесь с системой для диагностики ВИЧ-инфекции

игепатита В. Определите, что содержит каждый ингредиент и для чего применяется.

4.Иммуноблоттинг. Разберите схему постановки реакции; посмотрите демонстрационный результат реакции.

5.Радиоиммунный анализ (РИА) - разберите схему постановки и учёта реакции.

6.Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ). Посмотрите демонстрацию - результат реакции, составьте в рабочей тетради схему реакции, укажите стрелками антиген (вирус) и меченые антитела.

73

Занятие 17 Медицинские биологические препараты для лечения, профилактики

и диагностики инфекционных заболеваний

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения материала необходимо знать лечебнопрофилактические и диагностические препараты: источники и методы получения, классификацию, практическое применение.

Исходный уровень знаний

Вспомните и повторите весь предыдущий материал по иммунитету: антигены и антитела; виды приобретённого иммунитета; получение иммунных сывороток; диагностические препараты.

Цель занятия

Научиться:

- характеризовать диагностические и лечебно-профилактические препараты;

- подбирать препараты для иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных заболеваний.

План изучения темы

1.Изучение общей схемы «Медицинские иммунобиологические пре-

параты».

2.Вакцины: живые, убитые, химические, анатоксины, ассоциированные.

3.Антитоксические сыворотки.

4.Иммуноглобулины.

5.Аллергия, типы аллергических реакций. Аллергены.

После изучения темы студент должен уметь

1.Дать характеристику лечебно-профилактическим препаратам.

2.Подобрать препараты для профилактики и терапии инфекционных заболеваний.

Дополнительный материал к занятию

Вакцинами называются препараты, которые содержат антиген и применяются для создания в организме искусственного активного иммунитета. По природе содержащегося в них антигена различают вакцины:

1)живые;

2)убитые (инактивированные);

3)химические;

4)анатоксины;

5)ассоциированные.

По назначению и применению различают вакцины профилактические и лечебные. Вакцины и анатоксины с уменьшенной дозировкой антигена (БЦЖ-м,

74

АД-м и другие) применяют для вакцинации при наличии противопоказаний к прививкам обычными дозами вакцины и при ревакцинации.

1.Живые вакцины применяются при следующих заболеваниях: туберкулёз (БЦЖ и БЦЖ-м), чума, сыпной тиф (штамм ЕВ), туляремия, бруцеллёз, сибирская язва (СТИ), Ку-лихорадка (штамм М-44), грипп, корь, полиомиелит, эпидемический паротит, жёлтая лихорадка (штамм 17-Д).

2.Инактивированные (убитые) вакцины применяются для профилактики следующих заболеваний: полиомиелит, холера, брюшной тиф, лептоспироз, коклюш, сыпной тиф, бешенство (антирабическая культуральная вакцина), гепатит А, клещевой энцефалит, грипп, герпес.

3.Химические вакцины, в отличие от живых и убитых, не содержат микробных тел. Они содержат наиболее иммуногенные антигены, извлечённые тем или иным способом из микробных клеток. К ним относятся вакцины: брюшнотифозная (содержит О-антиген бактерий брюшного тифа, адсорбированный на гидроокиси алюминия), менингококковая (содержит капсульный полисахарид менингококка серогруппы А, В), холерная.

4.Анатоксины – препараты, полученные из белковых токсинов путём обработки их формалином и теплом. Анатоксины: стафилококковый нативный, стафилококковый адсорбированный, холероген-анатоксин, дифтерийный адсорбированный (АД, АД-м), дифтерийно-столбнячный (АДС, АДС-м), тетраанатоксин (ботулинический типов А, В, Е, столбнячный), трианатоксин (ботулинический А, В, Е), секстаанатоксин (анатоксины C. perfringens, C. novyi, ботулинический типов А, В, Е, столбнячный).

5.Ассоциированные вакцины содержат антигены, разные по своей природе. Ассоциированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС) содержит инактивированную или химическую коклюшную вакцину, дифтерийный и столбнячный анатоксины, адсорбированные на гидроокиси алюминия. Живая сухая комбинированная сыпнотифозная вакцина Е (ЖСКВ-Е) содержит высушенную живую культуру риккетсий Провачека авирулентного штамма Е в смеси с растворимым антигеном вирулентного штамма риккетсий. Холерная вакцина содержит холероген-анатоксин и О-антиген холерных вибрионов. Вакцина MMR содержит антигены возбудителей кори, эпидемического паротита и краснухи.

Получены генно-инженерные (рекомбинантные) вакцины против вирусов гепатита А и В.

Лечебные вакцины. Для лечебных целей применяют вакцины при некоторых хронических и вяло протекающих бактериальных и вирусных заболеваниях: бруцеллёзе (инактивированная вакцина), хронической гонорее (инактивированная вакцина), герпесе (герпетическая инактивированная вакцина), стафилококковых инфекциях (стафилококковый антифагин, стафилококковая вакцина), протейной инфекции, инфекциях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. Вакцины применяются для лечения соматических заболеваний различной этиологии (рассеянный склероз, диабет, наркомания и др.), а также онкологических заболеваний (БЦЖ («Имурон») – для лечения рака мочевого пузыря).

75

Лечебно-профилактические иммунные сыворотки содержат антитела и предназначены для создания в организме искусственного пассивного иммунитета. По характеру содержащихся в них антител сыворотки могут быть разделены на антитоксические, антимикробные и противовирусные. Антитоксические сыворотки – гетерологичные (лошадиные): противостолбнячная, противоботулинические (моновалентные типов А, В, С, Е и поливалентная), противодифтерийная, противогангренозные; гомологичные (донорские): антистафилококковая донорская плазма, антисинегнойная донорская плазма, иммуноглобулин противостафилококковый донорский, иммуноглобулин противостолбнячный донорский. Антимикробные иммуноглобулины (гетерологичные): противосибиреязвенный, лептоспирозный, антирабический (против бешенства), против клещевого энцефалита, японского энцефалита, против лихорадки Эбола; гомологичные (донорские) – нормальный человеческий иммуноглобулин (противокоревой), противопротейная донорская плазма, противогриппозный донорский гаммаглобулин.

К диагностическим препаратам относят:

диагностикумы (бактериальные, риккетсиозные, вирусные, грибковые, паразитарные);

антигены бактерий, вирусов;

диагностические иммунные сыворотки;

диагностические иммуноглобулины;

диагностические бактериофаги (используются для фагодиагностики и фаготипирования бактерий, что имеет эпидемиологическое значение);

аллергены (туберкулин, тулярин, бруцеллин, антраксин, чумин, орнитин, токсоплазмин и др.);

комплемент.

Препараты бактерифагов Диагностические иммунобиологические препараты широко применяются

для диагностики инфекционных болезней, аллергических состояний. Принцип действия диагностических препаратов основан на иммунологических реакциях (реакция антиген-антитело).

Контрольные вопросы

На чём основано практическое применение учения об иммунитете для профилактики и терапии? Что такое вакцины? Виды вакцин. Живые вакцины: способы получения вакцинных штаммов, требования, предъявляемые к ним. Что такое вакцинальная инфекция? Что представляют собой препараты живых вакцин, особенности хранения и транспортировки? Контроль живых вакцин. Приведите примеры. Инактивированные вакцины: что содержат, из каких штаммов приготовляются; этапы приготовления, консерванты; контроль инактивированных вакцин; что такое титр их? Условия хранения. Приведите примеры. Химические вакцины: определение понятия, приведите примеры. Понятие об адъювантах, смысл их применения. Анатоксины: что содержат; получение, очистка; нативные и очищенные сорбированные препараты

76

анатоксинов; перечислите применяемые на практике анатоксины. Реакция флоккуляции: что является антигеном, что антителами, как проявляется взаимодействие между ними; что такое инициальная флоккуляция, и в каком случае она наступает; в каких единицах измеряется активность анатоксинов? Ассоциированные вакцины: что содержат? Приведите примеры. Лечебные вакцины: при каких заболеваниях применяются, на чём основано их лечебное действие; приведите примеры.

Иммунные сыворотки: что содержат, как их получают, для какой цели используют? Как называются сыворотки, полученные от животных? От человека? Антитоксические сыворотки: получение, очистка, контроль, титрование; условия хранения, в каких единицах измеряется биологическая активность антитоксических сывороток? Какой вид иммунитета создаётся при введении их в организм, какова продолжительность иммунитета? Назовите антитоксические сыворотки, применяемые на практике. Какие осложнения могут возникуть при введении лечебных сывороток? Схема введения гетерологичных сывороток человеку. Иммуноглобулины: получение, очистка и концентрация; какое преимущество имеют иммуноглобулины перед сыворотками? Виды иммуноглобулинов, источники их получения. Приведите примеры. Как вводят гетерологичные иммуноглобулины, почему? Что такое аллергия? Типы аллергических реакций, их механизм. Какие явления относятся к аллергическим реакциям замедленного типа? Аллергические диагностические пробы: что вводят при постановке реакции, что наблюдается при положительной реакции, что означает положительная реакция? Назовите заболевания, при которых ставятся аллергические диагностические пробы (как называется проба, как называется аллерген). Что такое лекарственная аллергия, её формы, как она проявляется? Как выявляют повышенную чувствительность к антибиотикам?

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Заполните схему в рабочей тетради: «Медицинские иммунобиологические препараты».

Работа студента на практическом занятии

1. Титрование дифтерийного анатоксина методом флоккуляции.

Цель опыта: определить количество флоккулирующих единиц в 1 мл дифтерийного анатоксина.

Материал: перечислите ингредиенты реакции. Ход опыта: таблица из руководства.

Результат: отметьте, в какой пробирке произошла инициальная флоккуляция.

Вывод: запишите.

2. Контроль убитой вакцины.

Цель опыта: проверить убитую вакцину на стерильность, безвредность, определить титр.

Материал: вакцина, питательные среды, мыши, стандарт мутности, физ. раствор.

77

Ход опыта: таблица из руководства.

Результат: заполните графы в таблице; стерильность и безвредность - на следующем занятии.

3. Разбор медицинских биологических препаратов. Проведите разбор препаратов по схеме: к каким препаратам он относится (диагностический или лечебно-профилактический); действующее начало (антиген или антитело), как приготовлен или из чего состоит; для чего применяется, какое действие оказывает на организм (формирование какого вида иммунитета вызывает), дозируется ли и в каких единицах. В каких условиях следует хранить препарат.

Занятие 18 Итог по разделу «Инфекция и иммунитет»

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения материала студент должен ответить на все контрольные вопросы к итоговому занятию, быть готовым к выполнению практической задачи, то есть уметь правильно разбираться в биологических препаратах.

Исходный уровень знаний

Материал предыдущих занятий с 14 по 17.

Цель занятия

1.Систематизировать знания по инфекции и иммунитету.

2.Продемонстрировать овладение умениями, полученными при изучении раздела «Инфекция и иммунитет».

План изучения темы

1.Инфекция.

2.Элементы эпидемического процесса.

3.Иммунитет. Виды иммунитета.

4.Факторы врождённого иммунитета.

5.Приобретённый иммунитет.

6.Реакции иммунитета.

7.Медицинские биологические препараты для диагностики, профилактики и лечения.

После изучения раздела студент должен уметь

1.Оценить факторы врождённого иммунитета организма (гуморальные и клеточные).

2.Ставить, учитывать и интерпретировать результаты иммунологических реакций.

3.Давать характеристику диагностическим и лечебно-профилактическим препаратам.

78

4. Подбирать препараты для диагностики, профилактики и терапии инфекционных заболеваний.

Контрольные вопросы

(подробную расшифровку вопросов см. занятия 14-17).

1.Понятие об инфекционном процессе, условия возникновения и

развития.

2.Патогенность и вирулентность микробов. Факторы вирулентности.

3.Микробные токсины.

4.Характерные черты инфекционной болезни.

5.Формы проявления инфекционного процесса.

6.Элементы эпидемического процесса.

7.Условно-патогенные микробы и роль их в современной инфекционной патологии. ИСМП.

8.Иммунитет, определение понятия. Виды иммунитета.

9.Врождённые факторы защиты организма. Гуморальные защитные факторы крови.

10.Фагоцитарная теория И.И. Мечникова.

11.Понятие об антигенах. Антигены микробов и вирусов. Практическое применение.

12.Иммунная система организма. Органы иммунной системы. Иммунокомпетентные клетки.

13.Взаимодействие клеток в иммунном ответе. Клеточный и гуморальный иммунитет.

14.Понятие об антителах. Химическая природа, структура, классы иммуноглобулинов. Моноклональные антитела.

15.Динамика антителообразования. Особенности вторичного иммунного ответа. Иммунологическая память.

16.Реакции иммунитета: механизм, ингредиенты, практическое применение, способы постановки. Реакции нейтрализации токсина антитоксинами; реакция преципитации, реакция агглютинации; РНГА; РСК.

17.Реакции с участием меченых антигенов и антител: РИФ, ИФА, РИА,

ИЭМ.

18.Реакции иммунитета при вирусных заболеваниях.

19.Диагностические препараты, содержащие антигены.

20.Диагностические препараты, содержащие антитела.

21.Патология иммунного ответа. Иммунодефициты. Иммунофар-мако- логические средства.

22.Медицинские биологические препараты для профилактики и лечения инфекционных заболеваний.

23.Вакцины и анатоксины, виды вакцин, получение, применение.

24.Антитоксические сыворотки, получение, очистка, титрование, при-

менение.

25.Иммуноглобулины, получение, применение.

79

26.Понятие об аллергии, её типы. Гиперчувствительность немедленного типа. Методика введения гетерогенных лечебных сывороток.

27.Гиперчувствительность замедленного типа. Аллергические диагностические пробы. Аллергены.

28.Лекарственная аллергия.

Практическая задача. Каждый студент получает ампулу с биопрепаратом и должен охарактеризовать его, ответив на следующие вопросы: что содержит препарат (антиген, антитела, аллерген); как приготовлен; для чего применяется; если препарат диагностический, что обнаруживают с помощью этого препарата; дозируется ли препарат и в каких единицах?

Занятие 19 Патогенные стафилококки и стрептококки. Патогенные нейссерии

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения материала необходимо знать общую характеристику гноеродных кокков и их отдельных видов, морфологию, культуральные свойства, токсинообразование, факторы патогенности, усвоить принципы забора материала от больных и схемы микробиологической диагностики.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала темы необходимо повторить вопросы из курса общей микробиологии: основные формы бактерий, питательные среды (специальные, элективные), факторы патогенности микроорганизмов, методику определения чувствительности к антибиотикам.

Цель занятия

1.Ознакомиться с возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний: стафилококками, стрептококками, гонококками, менингококками, их морфологией, культуральными свойствами и факторами патогенности.

2.Изучить принципы лабораторной диагностики стафилококковых и стрептококковых заболеваний, инфекций, вызванных нейссериями.

План изучения темы

1.Основные формы бактерий, факторы патогенности микроорганизмов, методика определения чувствительности микробов к антибиотикам.

2.Общая характеристика патогенных кокков.

3.Основные свойства патогенных кокков (стафилококков, стрептококков, гонококков, менингококков, пневмококков): таксономия, морфология и тинкториальные свойства, токсинообразование, устойчивость к действию физических и химических факторов, патогенность для животных, способы заражения и клинические проявления болезни у человека, иммунитет, лабораторная диагностика, препараты для специфической терапии и профилактики.

80