107-15

образом, чтобы диаметры зон задержки роста стандартных тестмикроорганизмов соответствовали международным стандартам. Эта концентрация соответствует средней терапевтической дозе для стандартных штаммов микроорганизмов.

Приготовленную взвесь микроорганизмов засевают на поверхность специальной среды (АГВ или агар Мюллер-Хинтона) в чашки Петри. Затем стерильным пинцетом на засеянную поверхность помещают на равном расстоянии друг от друга, от краёв и центра чашки стандартные бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков (также можно использовать специальные устройства и диспенсеры). Засеянные чашки выдерживают в термостате при температуре, оптимальной для роста исследуемых бактерий. Если бактерии чувствительны к данному антибиотику, то вокруг диска образуется зона задержки роста. Диаметр зоны задержки роста соответствует степени чувствительности исследуемого микроорганизма к данному антибиотику. Окончательный результат оценивается по специальным таблицам, в которых указаны диаметры зон задержки роста стандартных культур, чувствительных, устойчивых и умеренно устойчивых.

Метод дисков не даёт надёжных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксину, ристомицину). Также этот метод не позволяет определить минимальную подавляющую концентрацию антибиотика.

Метод серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий (МПК, МИК). Для этого вначале готовят основной раствор, содержащий определённую концентрацию антибиотика (мкг/мл или ед/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Далее из основного раствора готовят все последующие разведения в бульоне (в объёме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 106-107 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона (без антибиотика) и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 370С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий, под влиянием содержащейся в ней минимальной подавляющей (ингибирующей) концентрации (МПК, МИК) антибиотика. Для оценки минимальной бактерицидной концентрации (МБК) производят высев на плотную питательную среду без антибиотика из пробирок с отсутствием роста. За МБК принимают минимальную концентрацию антибиотика, вызывающую гибель микроорганизма, что характеризуется отсутствием роста на чашках Петри с питательной средой.

Метод серийных разведений антибиотика в агаризованной среде. В

этом случае можно в одном опыте проверить чувствительность к разным концентрациям данного антибиотика нескольких культур микроорганизмов.

51

Различные разведения антибиотика готовят в стерильной агаризованной среде. Для этого в неё добавляют требуемое количество исходного раствора антибиотика, тщательно перемешивают и заливают в стерильные чашки Петри. После застывания агара дно чашки с наружной стороны делят маркером на сектора. Каждую исследуемую культуру засевают штрихом с помощью бактериологической петли на определённый сектор в чашки с разными концентрациями антибиотика. Посев исследуемых культур на чашки с различными концентрациями антибиотика можно сделать с помощью аппликатора, позволяющего засевать одновременно 12-15 культур на одну чашку. Затем чашки помещают в термостат при температуре, оптимальной для роста и развития изучаемых бактерий. Результаты учитывают по наличию или отсутствию роста бактерий в сравнении с ростом на среде в контрольной чашке. Бактерии считаются чувствительными к антибиотику в такой его концентрации, при которой их рост полностью подавляется.

Метод Е-тестов. Данный метод сочетает в себе достоинства метода серийных разведений и метода дисков. Вместо дисков используются полоски («линейки») фильтровальной бумаги, пропитанные антибиотиком, причём у основания полоски концентрация антибиотика будет минимальной, а на «верхушке» – максимальной. Полоски помещают на поверхность питательного агара, засеянного исследуемой культурой. Если бактерии чувствительны к действию данного препарата, вокруг участков полоски, содержащих его ингибирующие концентрации, возникает эллипсовидная зона задержки роста. Числовое значение концентрации антибиотика у основания этой зоны указывает на МПК данного антибиотика для данной культуры.

Кчувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков.

Кумеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата.

Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.

Контрольные вопросы

Дайте определение понятия «антибиотики». Основные группы антибиотиков в зависимости от способа получения: природные, полусинтетические, синтетические. Назовите фамилию учёного, разработавшего теорию химиотерапии. Какие свойства являются определяющими при выборе химиотерапевтического препарата? Что такое химиотерапевтический индекс, напишите его формулу, каким он должен быть? Укажите первые антиспирохетозные препараты; первый антибактериальный препарат и фамилию учёного, получившего его. Назовите фамилии русских учёных, впервые обнаруживших антибактериальные свойства зелёной плесени. Назовите фамилию учёного, изучавшего антибактериальные свойства

52

плесневого гриба Penicillium и сделавшего попытку выделить пенициллин. Учёные, впервые получившие препараты пенициллина. Продуценты антибиотиков: приведите примеры. Классификация антибиотиков по происхождению, химическому составу, по спектру действия. Механизм действия антибиотиков: мишени (точки приложения антибиотиков различных групп). Типы действия - бактерицидное и бактериостатическое; как в опыте in vitro определить их? Противовирусные антибиотики, механизмы их действия. Контроль антибиотиков на стерильность, безвредность, активность. Методы определения активности антибиотиков. В каких единицах измеряется активность антибиотиков? Условия хранения антибиотиков.

Назовите и охарактеризуйте возможные побочные явления при антибиотикотерапии. Дайте определение понятия «лекарственная устойчивость микробов». Виды лекарственной устойчивости. Природная и приобретённая (первичная и вторичная). Генетические механизмы лекарственной устойчивости: хромосомная и плазмидная. Фенотипические механизмы лекарственной устойчивости: назовите и охарактеризуйте. Рациональное применение антибиотиков: назовите способы. Назовите препараты - ингибиторы ферментов, разрушающих антибиотики. Опишите методы определения чувствительности микробов к антибиотикам.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Заполните таблицу в рабочей тетради: «Механизм действия антибиотиков».

Напишите:

1)возможные побочные явления при антибиотикотерапии;

2)способы предупреждения и преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов.

Работа студента на практическом занятии

1.Провести определение активности раствора антибиотика методом диффузии в агаре (учёт готового результата). Составить стандартную кривую. Для этого на графике по оси абсцисс отложить величину зон задержки роста тест-культуры для стандартного раствора, а по оси ординат - соответствующие концентрации. Начертить стандартную кривую. Затем измерить зоны задержки роста для испытуемого раствора антибиотика, отложить их величины по оси абсцисс, восстановить перпендикуляр до пересечения со стандартной кривой, провести линию, параллельную оси абсцисс, до пересечения её с осью ординат

иопределить концентрацию испытуемого антибиотика. Умножив полученную концентрацию на степень разведения, определяют активность в 1 мл раствора.

2.Провести определение активности раствора антибиотика методом серийных разведений (учёт готового результата).

3.Определение чувствительности бактерий (Е. coli (грамотрицательные палочки) S. aureus (грамположительные кокки)) к антибиотикам:

а) S. aureus штамм 209Р - музейный штамм, выделенный ещё до получения антибиотиков;

53

б) современный штамм S. aureus, свежевыделенный из гноя больного. Цель опыта: определить чувствительность бактерий к антибиотикам,

указать: природную устойчивость и приобретённую устойчивость.

Занятие 12 Бактериофагия. Медицинская биотехнология. Генетика микроорганизмов

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения материала необходимо знать:

1.Природу и свойства бактериофагов, методы их получения, титрования; использование в медицинской практике.

2.Структуру и особенности генома микроорганизмов.

3.Формы изменчивости микроорганизмов.

4.Внехромосомные генетические факторы.

5.Значение изменчивости микроорганизмов для медицины.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала темы необходимо повторить:

-особенности морфологии и физиологии вирусов;

-основные законы генетики;

-структуру генов и механизмы, обеспечивающие их функционирование, а также нарушения функции генов в результате мутаций.

Цель занятия

1.Изучить особенности строения бактериофагов.

2.Освоить методы получения и титрования бактериофагов. Ознакомиться

спрактическим использованием бактериофагов в медицине и микробиологии.

3.Ознакомиться:

-с особенностями генома бактериальной клетки, видами и формами изменчивости микроорганизмов;

-с практическим применением достижений генной инженерии.

План изучения темы

1.История открытия и изучения бактериофагов.

2.Природа бактериофагов, структура, основные свойства, специфичность.

3.Взаимодействие бактериофагов с бактериальными клетками.

4.Выделение и титрование бактериофагов, практическое применение и условия хранения.

5.Формы изменчивости микроорганизмов.

6.Значение изменчивости микроорганизмов для теории и практики медицины.

После изучения темы студент должен уметь

1. Установить феномен бактериофагии на плотных и жидких питательных средах, оценить полученные результаты.

54

2.Подобрать бактериофаг для профилактики и терапии инфекционных заболеваний.

3.Выявить проявления фенотипической изменчивости (модификации бактерий).

4.Интерпретировать результаты опыта по изучению фено- и генотипической изменчивости бактерий.

Дополнительный материал к занятию Количественные методы или методы титрования бактериофагов

Титрование бактериофагов проводится с использованием культур чувствительных бактерий в жидких и плотных питательных средах.

Метод титрования бактериофага по Аппельману (на жидкой питательной среде)

Готовят десятикратные разведения исследуемого бактериофага в питательном бульоне. Для этого в ряд пробирок разливают по 4,5 мл бульона. В 1-ю пробирку добавляют 0,5 мл исследуемого фага. Тщательно перемешивают и переносят в последующие пробирки (из пробирки в пробирку) по 0,5 мл соответствующего разведения фага с уменьшением его концентрации в десять раз. Получают разведения от 10-1 до 10-9 степени. Затем в пробирки вносят по 1 капле суточной культуры соответствующих бактерий. После инкубации в течение суток определяют титр фага. За титр бактериофага принимают то его максимальное разведение, при котором наблюдается полный лизис культуры (просветление среды).

Метод титрования бактериофага по Грациа (на плотной питательной среде)

Питательный агар разливают в чашки Петри и подсушивают в термостате. Готовят полужидкий питательный агар по 3-4 мл в пробирке и растапливают его на водяной бане. Делают десятикратные разведения исследуемого бактериофага

визотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл каждого разведения бактериофага смешивают с таким же объёмом суточной бульонной культуры чувствительных к бактериофагу бактерий и выливают эту смесь в пробирку с полужидким агаром температурой 45°C. Приготовленную смесь быстро выливают на поверхность первого слоя агара в чашке Петри, где она застывает

ввиде тонкого слоя. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют

при 37°C в течение суток. Смеси бактериофага, культуры и полужидкого агара делают из разведений фага 102-1010 в зависимости от предполагаемого титра фага.

Не заражённые бактериофагом бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности питательного агара. Каждая инфицированная бактериофагом бактерия лизируется и освобождает потомство бактериофага, которое внедряется в интактные клетки бактерий, и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне появляются «стерильные» пятна или негативные колонии бактериофага. Число этих пятен соответствует количеству фаговых частиц в засеянной смеси.

55

Количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии бактериофага называется его титром.

Фаготипирование бактерий

Метод фаготипирования имеет большое значение при эпидемиологических исследованиях, так как позволяет выявить источник и пути распространения возбудителей заболеваний. Определение фаговара выделенной чистой культуры проводят с помощью набора типовых диагностических бактериофагов. Фаговар культуры определяют по тому типовому фагу, который вызвал её лизис.

Для проведения фаготипирования исследуемую суточную культуру бактерий засевают «газоном» на поверхность питательного агара в чашки Петри, подсушивают в термостате, делят со стороны дна чашки на квадраты и наносят пипеткой по одной капле соответствующего бактериофага в тестразведении, указанном на ампуле. В один квадрат бактериофаг не вносят, для контроля роста культуры. Чашку термостатируют при 37оС 18-20 часов, после чего оценивают результат реакции. Положительный результат реакции фаголизиса – лизис культуры в месте нанесения бактериофага («негативные» колонии) при наличии роста в контроле свидетельствует о соответствии культуры бактериофагу и принадлежности с учётом её фаголизабельности к соответствующему виду.

Применение бактериофагов

Применяемые на практике препараты бактериофагов представляют собой фильтрат бульонной культуры соответствующих микробов, лизированных фагом, содержащий живые частицы фага, а также антигены бактерий, освободившиеся из бактериальных клеток при их лизисе. Полученный препарат

– жидкий бактериофаг – должен иметь вид совершенно прозрачной жидкости жёлтого цвета большей или меньшей интенсивности. Препарат проходит контроль на стерильность (методом посева), безвредность и литическую активность (титр).

Диагностические бактериофаги выпускаются как в жидкой, так и в сухой форме, в ампулах. Перед началом работы сухой бактериофаг разводится.

Для лечебно-профилактических целей бактериофаги выпускаются в форме таблеток с кислотоустойчивой оболочкой, в жидком виде или в суппозиториях. Таблетированный сухой бактериофаг более стабилен при хранении и удобен при применении. Одна таблетка сухого бактериофага соответствует 20-25 мл жидкого препарата. Срок годности сухого и жидкого препарата составляет 1 год. Жидкий бактериофаг следует хранить при температуре +2 – +100С, сухой – не выше +10С, но его можно хранить в холодильнике и при отрицательной температуре.

Принятый внутрь бактериофаг сохраняется в организме в течение 5-7 дней. Как правило, приём бактериофага не сопровождается какими-либо реакциями или осложнениями. Противопоказаний к приёму нет.

56

Бактериофаги могут применять также в виде орошений, полосканий, примочек, тампонов. Инъекционные формы бактериофагов можно вводить в

стерильные полости – брюшную, плевральную, суставную и в мочевой пузырь. Существует форма выпуска бактериофагов в свечах для ректального применения.

Контрольные вопросы

Назовите фамилии учёных, открывших явление бактериофагии. Природа бактериофага - к какому царству живых существ относится? Строение - какую форму чаще всего имеет, какие химические компоненты содержит; размеры - в каких единицах измеряется величина бактериофагов? Опишите фазы взаимодействия вирулентного бактериофага с чувствительной к нему бактериальной клеткой. Как обнаружить действие бактериофага на бактерии в жидкой и на плотной питательной среде? Как будет выглядеть положительный результат? Что такое титр бактериофага? Как его определяют и обозначают? Что такое умеренный бактериофаг. Опишите взаимодействие умеренного бактериофага с бактериальной клеткой. Применение бактериофагов в практической медицине, на каком свойстве оно основано? Лекарственные формы бактериофагов, каким требованиям они должны соответствовать? Условия хранения. Приведите примеры бактериофагов, применяющихся для лечения, для диагностики, для фаготипирования.

Дайте определение понятий «наследственность» и «изменчивость». Основные этапы развития учения о наследственности и изменчивости у микроорганизмов. Что такое генотип, фенотип? Особенности структуры генома прокариотов. Структурная модель ДНК по Уотсону и Крику. Что такое генетический код? Какими символами обозначаются генотип и фенотип бактерий? Перечислите внехромосомные факторы наследственности. Перечислите бактериальные плазмиды; какие свойства они кодируют? Что такое трансмиссивные, нетрансмиссивные плазмиды? Что такое транспозоны, Is-последовательности? Формы изменчивости микроорганизмов: генотипическая и фенотипическая. Механизмы наследственной изменчивости бактерий: мутации и рекомбинации, виды рекомбинаций. Укажите фамилию учёного, опыты которого с пневмококками наметили пути для поиска материальной основы наследственности. Опишите механизм трансформации, трансдукции, конъюгации. Применение генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний.

Достижения генетической инженерии и биотехнологии: перечислите основные продукты, применяемые в медицине. Геномная инженерия: методы, достижения. Значение изменчивости микроорганизмов для практической медицины.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Задача: на аптечном складе имеются препараты брюшнотифозного бактериофага: с титром 10-7 и 10-9. Какой из этих препаратов будет более активным? Почему?

57

Работа студента на практическом занятии

1.Проведите учёт опыта по определению чувствительности бактерий к антибиотикам. Заполните таблицу.

2.Проведите учёт опыта по титрованию бактериофага в жидкой питательной среде. Составьте таблицу, отметьте результат.

3.Изучите феномен бактериофагии в жидкой питательной среде и на плотной питательной среде. Отметьте проявления этого феномена и объясните, чем они обусловлены.

3.Изучите результат опыта фаготипирования стафилококков. Сделайте вывод: к какому фаготипу относится данная культура стафилококка?

4.Изучите препараты бактериофагов - лечебно-профилактические и диагностические.

5.Опыт по выявлению спонтанных мутаций у бактерий.

Цель опыта: определить, имеются ли мутанты, устойчивые к стрептомицину, в культуре бактерий, которая не соприкасалась со стрептомицином.

Методика: на чашке с МПА производится рассев культуры бактерий с целью получения изолированных колоний. После суточного инкубирования в термостате выросшие колонии с помощью игольчатого штампа-репликатора переносятся на чашку с МПА, содержащим стрептомицин, и контрольную чашку. После суточного инкубирования в термостате учитывают результат.

Результат: зарисовать чашки с колониями. Вывод: сформулировать.

6. Опыт бактериоциногении.

Цель: определить, какие из испытуемых культур кишечной палочки способны продуцировать колицины.

Методика: испытуемые культуры засеяны бляшками на чашке с МПА. После двухсуточной инкубации в термостате выросшие культуры убиты парами хлороформа. На поверхность посева наливается растопленный МПА, содержащий колицинчувствительную культуру. После инкубации в термостате учитывается результат по зонам отсутствия роста вокруг колоний колициногенных культур.

Результат: зарисовать.

Вывод: сформулировать (указать колициногенные культуры).

7. Диссоциация бактерий. Посмотреть с помощью бинокулярной лупы колонии эпидермального стафилококка: гладкие (S) и шероховатые (R).

Занятие 13 Итог по разделу «Физиология микробов. Санитарная микробиология.

Санитарно-микробиологический контроль в фармацевтических учреждениях.

Химиотерапевтические препараты. Антибиотики. Бактериофагия. Медицинская биотехнология. Генетика микроорганизмов»

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения материала студент должен быть готов ответить на все вопросы к итоговому занятию.

58

Исходный уровень знаний

Материал предыдущих занятий с 5 по 12

Цель занятия

1.Систематизировать знания по физиологии микробов, микробиологическому контролю в аптеках, антибиотикам и химиотерапии, бактериофагии, генетике микроорганизмов.

2.Продемонстрировать умения, полученные при изучении физиологии микробов, микробиологического контроля в аптеках, антибиотиков, химиотерапии, бактериофагии, генетике микроорганизмов.

План изучения темы

1.Химический состав и метаболизм микробов.

2.Культивирование микробов.

3.Распространение микробов в природе и роль их в круговороте

веществ.

4.Влияние факторов внешней среды на микробы.

5.Микробиологический контроль в аптеках.

6.Микробиологические исследования лекарственных средств.

7.Антибиотики и химиотерапия.

8.Бактериофагия, генетика микроорганизмов.

После изучения раздела студент должен уметь

1.Владеть техникой посева бактерий на жидкие и плотные среды.

2.Охарактеризовать предложенные питательные среды, применяемые в микробиологической практике.

2. Охарактеризовать колонии микроорганизмов.

4.Провести посев исследуемого материала на чашку МПА для получения изолированных колоний.

5.Провести посев изолированных колоний на скошенный питательный

агар.

6.Проводить оценку санитарно-бактериологического состояния воздуха, воды, почвы по микробиологическим показателям.

7.Выбрать средства, режим стерилизации в соответствии с конкретными задачами.

7. Выбирать методы для предстерилизационной обработки предметов медицинского назначения и дезинфекции.

9.Проводить санитарно-бактериологические исследования аптечных учреждений.

10.Проводить микробиологическое исследование лекарственного сырья.

10.Проводить микробиологическое исследование лекарственных средств.

11.Определять активность антибиотиков методом диффузии в агар и методом серийных разведений;

12.Определять чувствительность исследуемой культуры микроорганизмов к антибиотикам диско-диффузионным методом.

59

13.Определять титр бактериофага на жидкой питательной среде.

14.Подобрать бактериофаг для профилактики и терапии инфекционных заболеваний.

15.Выявить проявления фенотипической изменчивости (модификации бактерий).

16.Интерпретировать результаты опыта по изучению фено- и генотипической изменчивости бактерий.

Контрольные вопросы

(подробную расшифровку вопросов см. занятия 5-12)

1.Основные компоненты химического состава бактериальной клетки, их функции.

2.Питание бактерий. Особенности питания бактерий.

3.Механизмы питания бактерий.

4.Типы питания микробов.

5.Общие требования к искусственным питательным средам.

6.Классификация питательных сред по происхождению, по консистенции, по составу и назначению.

7.Простые питательные среды, их приготовление и стерилизация.

8.Специальные питательные среды, их примеры. Элективные питательные среды, их примеры.

9.Дифференциально-диагностические среды, их примеры.

10.Типы биологического окисления микробов. Аэробный тип биологического окисления, признаки, присущие ему.

11.Анаэробный тип биологического окисления, признаки, присущие ему. Учёный, открывший анаэробный тип биологического окисления.

12.Брожение. Учёный, открывший микробную природу брожения. Виды брожения.

13.Классификация микробов по типу биологического окисления.

Примеры.

14.Окислительно-восстановительный потенциал среды.

15.Рост и размножение бактерий, скорость и фазы размножения бактерий.

16.Методы культивирования и характер роста аэробов и анаэробов.

17.Выделение чистой культуры бактерий.

18.Пигменты микробов. Продукция микробами ароматических веществ, тепловой и световой энергии.

19.Ферменты микробов, их классификация.

20.Использование бактериальных ферментов в медицине.

21.Определение ферментативной активности бактерий для их иденти-

фикации.

22.Классификация микробов в зависимости от температуры, при которой они могут размножаться.

23.Понятие о стерилизации, дезинфекции, асептике, антисептике.

24.Стерилизация сухим жаром.

25.Стерилизация паром под давлением.

60