107-15

11.Люминесцентная микроскопия.

12.Фазово-контрастная микроскопия.

13.Электронная микроскопия.

14.Морфология бактерий. Место их среди микроорганизмов, основные формы, размеры.

15.Приготовление и окраска препаратов-мазков.

16.Принцип и метод окраски по Граму в модификации Синёва.

17.Отношение бактерий к окраске по Граму. Различия между ними по строению клеточной стенки и по чувствительности к антибактериальным веществам.

18.Принципы и метод окраски по Цилю-Нильсену.

19.Структурные элементы бактериальной клетки. Какие из них зависят от условий существования бактерии?

20.Клеточная стенка, её строение, биологическая роль, способы обнаружения.

21.Цитоплазматическая мембрана, её строение, биологическая роль. Мезосомы.

22.Споры бактерий, их биологическая роль, условия и время, необходимые для их образования и для прорастания спор в вегетативные формы. Способы обнаружения спор. Бактерии, образующие споры.

23.Капсула бактерий, её биологическая роль, способ обнаружения. Бактерии, образующие капсулы.

24.Включения бактериальной клетки, их биологическая роль, способы обнаружения. Практическое значение.

25.Жгутики бактерий, их биологическая роль, число и расположение, способы обнаружения.

26.Пили (ворсинки, фимбрии), локализация, типы, биологическая роль, способ обнаружения.

27.Микроскопические грибы: положение среди микроорганизмов, строение, способы размножения; группы грибов, имеющих практическое значение.

28.Дрожжеподобные грибы рода Candida.

29.Актиномицеты, их положение среди микроорганизмов, строение, значение в жизни человека.

30.Спирохеты, их положение среди микроорганизмов, строение. Патогенные представители.

31.Простейшие, их положение среди микроорганизмов. Патогенные представители. Способ окраски.

32.Микоплазмы, их положение среди микроорганизмов, строение, сходство с L-формами и отличие.

33.Риккетсии, положение среди микроорганизмов, морфологические типы, патогенные представители.

34.Хламидии, их положение среди микроорганизмов, особенности морфологии, патогенные представители.

21

Работа студента на практическом занятии

Подведение итога по разделу «Морфология микробов». Выполнение контрольных заданий. Ответы на контрольные вопросы.

Занятие 5 Питание. Питательные среды.

Методы культивирования и выделения чистых культур бактерий-аэробов

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения материала необходимо знать:

-химический состав бактериальной клетки; типы, механизм питания, питательные среды, их состав и назначение;

-типы биологического окисления у микроорганизмов;

-методы культивирования и выделения чистой культуры аэробов и анаэробов.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала необходимо повторить:

-основные группы веществ: белки, жиры, углеводы, нуклеиновые кислоты, минеральные вещества, их функции;

-механизмы биологического окисления, окислительно-восстановитель- ный потенциал;

-приготовление мазка, окраска по Граму в модификации Синёва.

Цель занятия

1. Изучить:

-особенности метаболизма микроорганизмов, принципы их культивирования в лабораторных условиях;

-наборы питательных сред;

-классификации сред по происхождению, консистенции, составу, назначению;

-характер роста бактерий на жидких и плотных питательных средах, с различными типами колоний.

2. Освоить технику посева для выделения чистых культур бактерий.

План изучения темы

1.Химический состав бактериальной клетки.

2.Механизм питания микроорганизмов, типы питания.

3.Питательные среды.

4.Рост и размножение микроорганизмов.

5.Выделение чистой культуры бактерий-аэробов.

После изучения темы студент должен уметь

1.Владеть техникой посева бактерий на жидкие и плотные среды.

2.Охарактеризовать предложенные питательные среды, применяемые в микробиологической практике.

22

Дополнительный материал к занятию

Выделение чистой культуры бактерий-аэробов из материала, содержащего смесь микробов, занимает, как правило, 3 дня и производится по следующей схеме:

1 день - микроскопия мазка из исследуемого материала, окрашенного по Грамму, для предварительного ознакомления с микрофлорой данной смеси. Посев материала петлей на чашку Петри с питательной средой штриховым методом для получения изолированных колоний. Засеянные чашки помещают в термостат на сутки.

2день - изучение колоний, выросших на чашках, отбор изолированных колоний, описание их и микроскопия мазков из изолированных колоний (окраска по Граму) для проверки однородности микробов в колонии. Пересев изолированной колонии на скошенный агар для получения чистой культуры. Посевы помещают в термостат на сутки.

3день - проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре, путём микроскопии мазков, окрашенных по Граму. При однородности исследуемых бактерий выделение чистой культуры можно считать законченным.

Контрольные вопросы

Химический состав бактериальной клетки: содержание, локализация в клеточных структурах и биологическая роль воды, белков, нуклеиновых кислот, липоидов, углеводов, минеральных веществ. Что такое энергетический и конструктивный метаболизм (катаболизм и анаболизм)? Особенности обмена веществ бактерий. Механизм расщепления бактериями питательных веществ. Способы поступления их в клетку. Типы питания микробов. Могут ли микроорганизмы изменить тип питания? Какие типы питания имеются у патогенных микробов? Питательные среды: для чего применяются, каким требованиям они должны соответствовать? Классификация питательных сред по составу, по консистенции, по назначению. Обычные (простые) питательные среды. Специальные питательные среды, для чего применяются, принцип их действия. Дифференциально-диагностические среды, принципы их действия, для чего применяются, примеры. Что такое рост микроба? Что такое размножение микроба? Как размножаются бактерии? Фазы роста бактериальной культуры. Размножение бактерий в непрерывно-проточной среде. Культивирование бактерий. Что такое культура бактерий, чистая культура, штамм, клон? Методы выделения чистой культуры бактерий. Рассказать поэтапно (по дням) выделение чистой культуры бактерий. Что такое колония микробов?

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

1.Напишите в рабочей тетради классификацию питательных сред (приведите примеры): по происхождению, по консистенции, по назначению.

2.Составьте и начертите схему выделения чистой культуры бактерий по дням и укажите цель своих действий на каждом этапе.

23

Работа студента на практическом занятии

1.Питательные среды. Посмотрите набор питательных сред, классифицируйте их по происхождению, консистенции, составу. Особое внимание обратите на назначение питательных сред.

2.Выделение чистой культуры бактерий (1 день). Возьмите пробирку со смесью микробов, осмотрите её. Приготовьте мазок. При работе с жидким материалом самое главное - не пролить! Держите пробирку всегда отверстием вверх. Взяв из пробирки каплю материала, сначала закройте её пробкой, поставьте в штатив и только после этого наносите взятый петлей материал на предметное стекло. Мазок окрасьте по Граму в модификации Синёва, промикроскопируйте, зарисуйте. Затем посейте исследуемый материал на чашку с мясо-пептонным агаром (МПА). Укажите на чашке номер рабочего места и группы. Положите чашку кверху дном в ящик на подготовительном столе.

Занятие 6 Биологическое окисление у микроорганизмов. Рост и размножение,

культуральные свойства микроорганизмов. Выделение чистых культур бактерий (продолжение). Действие физических и химических факторов.

Методы стерилизации. Дезинфицирующие средства, консерванты

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения материала необходимо знать:

-культуральные свойства микробов;

-устройство термостата;

-понятия о стерилизации, дезинфекции, асептике и антисептике;

-методы стерилизации.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала необходимо повторить:

-схему выделения чистой культуры аэробов и анаэробов;

-условия, необходимые для культивирования микробов;

-характеристику роста микробов на плотных и на жидких питательных средах; морфологию колоний микробов, пигменты микробов.

Цель занятия

1.Изучить культуральные свойства бактерий.

2.Ознакомиться с особенностями бактериологического метода выделения чистых культур анаэробных микроорганизмов.

3.Ознакомиться с основными методами стерилизации, применяемыми в микробиологии и медицине.

План изучения темы

1. Схема выделения чистых культур бактерий.

24

2.Биологическое окисление (энергетический метаболизм) микроорганизмов: типы, механизм аэробного и анаэробного биологического окисления, классификация микроорганизмов по типу дыхания.

3.Методы культивирования анаэробов.

4.Культуральные свойства микробов:

а) условия, необходимые для культивирования данного вида (питательная среда, рН, rH2, температура, аэробные и анаэробные условия);

б) характер роста данного вида микробов на питательных средах.

5.Пигменты микробов.

6.Термостат и его устройство.

7.Действие физических факторов на микроорганизмы: а) действие низкой и высокой температуры; б) влияние высушивания; в) действие лучистой энергии.

8.Методы стерилизации;

9.Действие химических факторов на микроорганизмы. Дезинфекция, дезинфицирующие вещества, механизм их действия.

После изучения темы студент должен уметь

1.Характеризовать колонии микроорганизмов.

2.Производить посев изолированных колоний на скошенный питательный агар.

3.Выбрать средства, режим стерилизации в соответствии с конкретными задачами.

Дополнительный материал к занятию «Методы стерилизации»

25

Методы контроля стерильности

Микробиологический контроль объектов, подвергшихся стерилизации, проводится регулярно.

Контроль работы аппаратуры для стерилизации осуществляется несколькими способами:

1.Персонал должен строго соблюдать установленный режим стерилизации, который обеспечивает гибель микробов.

2.Соответствующей службой должен регулярно проводиться технический контроль аппаратуры для стерилизации.

3.Косвенно о поддержании определённой температуры при стерилизации можно судить по изменению окраски химических индикаторов, которые помещают на поверхность и в глубину стерилизуемого объекта. Создана комплексная система оперативного контроля критических параметров паровой и воздушной стерилизации с помощью индикаторов серий «МедИС», «СТЕРИКОНТ», «СТЕРИТЕСТ», «ИНТЕСТ», «ФАРМАТЕСТ», «СВИДЕТЕЛИ». Индикаторы серий «МедИС» и «СТЕРИКОНТ» предназначены для контроля всех критических параметров паровой или воздушной стерилизации в камере стерилизатора (снаружи стерилизуемых упаковок). Индикаторы серии «СТЕРИТЕСТ» предназначены для контроля всех критических параметров паровой и воздушной стерилизации внутри стерилизуемых упаковок. Индикаторы серии «ИНТЕСТ» предназначены для контроля всех критических параметров паровой

ивоздушной стерилизации как в камере стерилизатора, так и внутри стерилизуемых упаковок. Индикаторы серии «ФАРМАТЕСТ» предназначены для контроля всех критических параметров паровой или воздушной стерилизации как в камере стерилизатора, так и внутри стерилизуемых флаконов с растворами и питательными средами. Индикаторы серии «СВИДЕТЕЛИ» предназначены для визуального отличия упаковок, прошедших стерилизацию, от нестерилизованных и исключения риска смешения потоков стерилизованных и не стерилизованных изделий.

Преимущества индикаторов:

- чёткий, контрастный цветовой переход облегчает визуальный контроль и повышает его точность;

- на каждом индикаторе напечатан эталон конечного цвета индикаторной метки, который она приобретает при соблюдении параметров стерилизации;

- липкий слой на обратной стороне индикатора облегчает его закрепление на стерилизуемых упаковках и подклеивание в журнал контроля.

4.Микробиологический контроль стерилизации проводится с помощью посевов кусочков стерилизуемого материала, смывов с предметов, подвергшихся стерилизации, на среды, позволяющие обнаружить аэробные и анаэробные бактерии, грибы (сахарный бульон, тиогликолевая среда, среда Сабуро). Отсутствие роста после 14 дней инкубации в термостате свидетельствует о стерильности предмета. Кроме того, для контроля процесса стерилизации применяются тест-культуры спор Bacillus stearothermophilus (для контроля работы паровых стерилизаторов) и Bacillus licheniformis B-6 (для

воздушных стерилизаторов). Тест-культуры помещают в камеры для

26

стерилизации и после её окончания высевают на питательные среды с последующей инкубацией в термостате.

Для сохранения стерильности предметы должны иметь упаковку, не допускающую микробного загрязнения. С этой целью применяют полимерную плёнку, бумагу, фольгу, биксы, металлические пеналы, флаконы.

Методы частичного обеспложивания

Кипячение - погибают только вегетативные формы бактерий, споры могут выживать; метод применяется для обработки игл, инструментов многоразового использования (кипячение в течение 30 минут с добавлением в воду 1% бикарбоната натрия), для обработки некоторых инъекционных растворов (не переносящих автоклавирования), которые до стерилизации должны отвечать очень высокому стандарту чистоты. Для стерилизации питательных сред этот метод не применяется.

Фильтрование - освобождение жидкостей от микробов в тех случаях, когда материал не может быть подвергнут нагреванию (сыворотка, ряд лекарственных растворов). Фильтры имеют настолько малые поры, что задерживают микробы, но вирусы проникают через них. Поэтому фильтрат от вирусов не освобождается. Фильтрование производится или под повышенным давлением, и жидкость нагнетается через поры, или создаётся разрежение, и жидкость всасывается через фильтр в приёмник. Стерильность профильтрованной жидкости проверяется путём посева её на питательную среду. Фильтры и приёмники должны быть стерильными.

Пастеризация - способ основан на том, что при нагревании до 50-60°С в течение 30 минут, или 70-80°С – в течение 5-10 минут, или 90°С – 2 минуты погибает большинство бесспоровых микробов. Споры остаются жизнеспособными. Метод применяется для пастеризации молока, вина, компотов и т.д. Пастеризованные продукты нужно хранить на холоде, чтобы не проросли споры.

Контрольные вопросы

Как происходит процесс биологического окисления у микробов? Какие различия между аэробным и анаэробным типом биологического окисления (основные этапы, ферменты, участие свободного кислорода, конечный акцептор водорода, продукты окисления). Что такое брожение, виды брожения. На какие группы можно разделить микробы по способу биологического окисления? Перечислите виды бактерий-анаэробов. Что такое окислительновосстановительный потенциал среды, какие микробы лучше растут при низких его значениях, какие - при более высоких? Что такое аэрация питательной среды, как она осуществляется? Методы культивирования анаэробов. Среда Китта-Тароцци: на чём основано её действие, что входит в её состав, что делают со средой перед посевом и для чего? Что входит в понятие «культуральные свойства» бактерий, для чего их изучают? Характер роста микробов на жидких и плотных питательных средах. Приведите примеры. Пигменты микробов, их характеристика, условия образования, примеры пигментных микробов.

27

Дифференциация микробов по отношению к температурному режиму. Что такое психрофилы, мезофилы, термофилы? Оптимальные температуры для роста патогенных микробов. Термостат, его назначение и устройство. Как влияет на бактерии высушивание? Что такое лиофильное высушивание и для чего его применяют? Какие виды лучистой энергии губительно действуют на микробы и применяются на практике?

Определите понятия: асептика, антисептика, дезинфекция, стерилизация. Перечислите методы стерилизации, охарактеризуйте каждый из них: аппаратура, режим стерилизации (температура и время), стерилизуемые материалы, контроль успешной стерилизации. Методы контроля стерильности: физическим методом; биологическим методом (назовите применяемый микроб). Как простерилизовать: стеклянную посуду, МПА, мясо-пептонный бульон (МПБ), среды Гисса, физиологический раствор, питательную среду, содержащую белок? Стерилизация дробными методами. Режим стерилизации. Кипячение - режим; какие микробы погибают? Какие материалы подвергают кипячению? Фильтрование: в каких случаях применяется, что собой представляют фильтры, условия фильтрования. От чего не освобождается профильтрованная жидкость? Пастеризация: как проводится, для чего применяется? Как надо хранить пастеризованные продукты? Стерильны ли пастеризованные продукты? Химическая стерилизация: для чего её применяют? Как проводится газовая стерилизация? Методы консервации медицинских препаратов: в каких случаях проводится консервация; требования, которым должны отвечать консерванты для лекарственных средств, приведите примеры консервантов.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

1.Перечислите методы культивирования бактерий-анаэробов: физические, химические биологические, комбинированные.

2.Заполните таблицу в рабочей тетради: «Пигменты микробов».

3.Заполните таблицу в рабочей тетради: «Механизм действия дезинфицирующих веществ».

Работа студента на практическом занятии

1. Выделение чистой культуры бактерий-аэробов (2-й день). Посмотрите свои посевы на чашках, опишите 2 типа колоний (таблица). Выберите изолированные колонии, приготовьте из них мазки, окрасьте по Граму в модификации Синёва, промикроскопируйте, убедитесь в однородности культуры, зарисуйте. Сделайте пересев на скошенный агар из той же колонии, из которой делали мазок (каждый студент делает пересев из одной колонии. Из двух сидящих рядом студентов один делает пересев из колонии первого типа, а другой - из колонии второго типа). Засеянные пробирки подпишите: номер рабочего места, номер группы, тип колонии.

Запись в тетради: Выделение чистой культуры аэробов (2-й день). Заполните приготовленную таблицу. Подписи к рисункам: мазок из колонии 1 типа, мазок из колонии 2 типа.

28

2.Культивирование и выделение чистых культур бактерий-анаэробов - разбор по таблицам.

3.Культуральные свойства микробов. Посмотрите характер роста микробов на жидких и плотных средах.

4.Пигменты микробов. Посмотрите набор пигментных бактерий.

5.Для предстоящего опыта поставьте культуру микробов в морозильную камеру. Опыт действия физических и химических факторов на микроорганизмы. Группа студентов делится на 4 бригады. Каждая бригада получает:

- одну из культур микробов (в виде 2 пробирок взвеси в физиологическом растворе): Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida albicans;

- одну чашку МПА, которую надо разделить на 6 секторов; - пробирку с 5% раствором фенола; - стерильную пипетку.

Цель опыта: определить, оказывает ли губительное действие на данный вид микроба: замораживание, кипячение, 5% раствор фенола (через 5, 15, 30 минут).

Ход опыта: одна пробирка с взвесью микроба помещается в морозильную камеру в начале занятия; из второй пробирки сделайте петлей высев на один из секторов чашки МПА (контроль). Из этой же пробирки 0,2 мл внесите в 5% раствор фенола и затем из этого раствора делайте петлей высевы на сектора чашки через 5, 15, 30 минут. Оставшуюся в пробирке взвесь микроба прокипятите на спиртовке и после этого сделайте высев на сектор чашки МПА.

Вконце занятия сделайте высев из пробирки, которая находилась в

морозильной камере. Таким образом, на секторах чашки будут посевы: 1) контроль; 2) кипячение; 3) замораживание; действие 5% раствора фенола в течение 4) 5 минут; 5) 15 минут; 6) 30 минут.

6.Произведите учет опыта Бухнера (действие УФ лучей на бактерии).

7.Ознакомьтесь с аппаратурой, применяемой для стерилизации и частичного обеспложивания: аппарат для суховоздушной стерилизации, аппарат Коха, автоклав, водяная баня, бактериальные фильтры; тесты для химического и биологического контроля стерильности.

Занятие 7 Идентификация чистых культур бактерий. Биохимическая активность

микробов. Выделение чистых культур микроорганизмов (окончание). Действие физических и химических факторов (окончание).

Микрофлора организма человека

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения материала необходимо знать ферменты микробов; методы определения ферментативной активности микробов, применяемые для этого питательные среды.

29

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала темы необходимо повторить:

-выделение чистой культуры аэробов и анаэробов;

-питательные среды.

Цель занятия

1.Изучить принципы идентификации чистых культур по морфологическим, культуральным, биохимическим и другим свойствам.

2.Показать разнообразие ферментов у микроорганизмов и возможности их использования для идентификации.

План изучения темы

1.Выделение чистой культуры (по дням).

2.Ферменты бактерий.

3.Питательные среды для изучения биохимической активности бактерий.

4.Действие на микроорганизмы физических и химических факторов.

После изучения темы студент должен уметь

1.Охарактеризовать колонии микроорганизмов.

2.Оценивать биохимическую активность микроорганизмов.

Дополнительный материал к занятию

Разные виды бактерий, в том числе имеющие одинаковую морфологию, могут отличаться по ферментативной активности. Поэтому невозможно такие виды идентифицировать только по их морфологии. После выделения чистой культуры бактерий изучают их ферментативную активность (биохимические свойства). Для этого применяются дифференциально-диагностические среды, например, среды Гисса, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева в чашках Петри. Последние три среды применяются для дифференциации бактерий кишечной группы по их способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде (индикатор рН). Если посеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, например, кишечную палочку, то в результате сбраживания лактозы образуются кислые продукты и индикатор изменяет свой цвет. Поэтому колонии кишечной палочки на таких средах будут окрашены соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоскирева - в красный цвет, на среде Левина в чёрносиний. Если же на эти среды посеять бактерии, которые не сбраживают лактозу, реакция среды останется слабо-щелочной и цвет индикатора не изменится. Поэтому колонии бактерий на этих средах будут бесцветными. Среду Плоскирева можно отнести также к элективным средам для выделения палочек дизентерии, так как эта среда содержит соли желчных кислот, задерживающих рост кишечной палочки, и краситель бриллиантовый зелёный, задерживающий рост воздушной кокковой флоры.

Дифференциально-диагностические среды Гисса («пёстрого» ряда) готовятся на основе жидкой среды (пептонной воды) или полужидкого мясо-

30