107-15

Приготовление фиксированных препаратов из культур микроорганизмов

Приготовление окрашенного препарата из культуры микроорганизмов

микроорганизмов, выросшей на поверхности плотной питательной среды, на обезжиренное предметное стекло наносят петлей небольшую каплю физиологического раствора, располагая её в центре круга, нарисованного с обратной стороны карандашом по стеклу. При работе спиртовка должна находиться прямо перед вами, на удобном для работы расстоянии. Предметное стекло должно находиться в чашке Петри или лотке: категорически запрещается готовить мазки на предметном стекле, лежащем на столе! В

правую руку берут бактериологическую петлю, в левую - пробирку с культурой. Петлю стерилизуют, внося её в пламя горелки в вертикальном положении. После того как петля раскалится докрасна, проводят конец петледержателя через пламя. После этого из пробирки вынимают пробку, удерживая её мизинцем правой руки. После обжигания на спиртовке края пробирки в неё вносят петлю, которую охлаждают, прикасаясь к стенкам пробирки. Затем петлей с поверхности среды снимают небольшое количество культуры. Не касаясь стенок пробирки, вынимают петлю и закрывают пробирку пробкой над спиртовкой. После этого пробирку с культурой помещают в штатив, а культуру на петле вносят в приготовленную заранее каплю физиологического раствора, хорошо размешивают и равномерно распределяют по стеклу в виде небольшого круга или овала 1-1,5 см в диаметре. По окончании приготовления мазка петлю вновь стерилизуют в пламени спиртовки.

Для приготовления мазка из бульонной культуры на предметное стекло наносят 1-2 петли исследуемого материала, стерилизуя петлю перед каждым погружением в бульонную культуру микроорганизма, как описано выше, и равномерно распределяют по стеклу (в этом случае не требуется предварительного нанесения на стекло физиологического раствора).

Высушивание мазка. Высушивание мазка производится на воздухе. Для ускорения высушивания предметное стекло с мазком, обращённым кверху, можно подержать в струе тёплого воздуха высоко над пламенем спиртовки, не внося препарат в пламя.

Фиксация мазка. Для этого используют физический и химический методы. Физический метод заключается в фиксации мазка над пламенем спиртовки в течение нескольких секунд мазком вверх (троекратно по 1 секунде). Эту операцию проводят достаточно быстро, стараясь не перегреть мазок, так как при перегревании могут произойти изменения морфологии клетки. Химический метод фиксации является более мягким по сравнению с фиксацией на пламени. В качестве фиксаторов используют этанол, ацетон, смесь Никифорова (эквивалентное соотношение этанола и эфира), метанол, формалин. После фиксации мазок можно окрашивать.

Окраска мазка. Для окраски мазка следуют предписаниям для каждой методики окраски. При окраске простым способом на мазок наносят несколько

11

капель раствора красителя так, чтобы весь мазок был покрыт им. Краситель оставляют на определённое время. Затем препарат промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой.

Техника окраска по Граму в модификации Синёва

1.На фиксированный препарат наносят 2-3 капли воды и кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанной краской генцианвиолет. Окрашивают 1-2 минуты.

2.Снимают бумажку, сливают краску и, не промывая водой, наливают на препарат раствор Люголя на 1 минуту.

3.Сливают раствор Люголя и наливают на препарат спирт с йодом на 30 секунд. Промывают водой.

4.После этого окрашивают мазок водным фуксином в течение 1 минуты.

5.Промывают водой, высушивают препарат фильтровальной бумагой, микроскопируют. В результате окраски грамположительные микробы окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный.

Отношение бактерий к окраске по Граму

Кокки окрашиваются по Граму положительно, за исключением гонококков и менингококков. Палочки, не образующие спор, грамотрицательны, за исключением палочек дифтерии, туберкулёза и проказы. Палочки, образующие споры (бациллы и клостридии) - грамположительны. Извитые формы (вибрионы и спириллы) грамотрицательны.

Окраска по Цилю-Нильсену

1.На фиксированный препарат помещают полоску фильтровальной бумаги, наливают карболовый фуксин Циля и осторожно нагревают на горелке до появления пара, не допуская кипения жидкости. Нагревание повторяют 3 раза.

2.Снимают бумагу, промывают водой.

3.Погружают 3 раза в 5% раствор серной кислоты.

4.Промывают препарат водой и докрашивают метиленовой синью 5

минут.

5.Промывают водой, высушивают препарат фильтровальной бумагой, микроскопируют.

Контрольные вопросы

Перечислите и охарактеризуйте основные этапы развития микробиологии. Назовите основные открытия Л. Пастера, Р. Коха, И.И. Мечникова. Заслуги отечественных учёных в развитии микробиологии. Назовите отрасли микробиологии, разделы медицинской микробиологии. Значение микробиологии в работе провизора. Положение микроорганизмов среди других живых существ. Перечислите основные группы микроорганизмов. По каким признакам отличаются между собой эукариоты и прокариоты? Основные формы бактерий. Как называются кокки, располагающиеся: попарно, цепочкой, гроздьями, по четыре, пакетами? Как называются палочки, образующие споры? Как называются палочки, не образующие споры? Как называются извитые формы с одним завитком спирали? Как называются извитые формы с

12

несколькими завитками? Методы исследования в микробиологии. Микроскопический метод: что изучает, с помощью чего? Устройство светового микроскопа. Что такое иммерсионная система? Правила работы с иммерсионной системой. Что такое разрешающая способность микроскопа и чему она равна у микроскопа с иммерсионной системой? Какова роль иммерсионного масла? Каким свойством должно обладать иммерсионное масло? Куда помещают иммерсионное масло при микроскопии? Нужно ли применять иммерсионное масло при микроскопии с объективом: x8, x40, x90?

Этапы приготовления препарата-мазка. Для чего фиксируют мазок? Способы фиксации мазков. Какие способы окраски называются простыми? Какие красители применяются для окраски бактерий? Какие способы окраски называются сложными, на чём они основаны? Как производится окраска по Граму в модификации Синёва: в какой цвет окрашиваются грамположительные бактерии, почему? В какой цвет окрашиваются грамотрицательные бактерии, почему? Чем обусловлена способность бактерий различно окрашиваться по Граму? Какие бактерии (кокки, палочки, извитые) красятся по Граму положительно и какие отрицательно? Из каких слоёв состоит клеточная стенка грамположительных и грамотрицательных бактерий? Какие бактерии (грамположительные или грамотрицательные) более чувствительны: а) к пенициллину, детергентам, к основным красителям; б) к азидам, окислителям, стрептомицину, переваривающему действию протеаз? Принцип и техника окраски по Цилю-Нильсену. Какие патогенные бактерии являются кислотоустойчивыми?

Работа студента на практическом занятии

1.Промикроскопируйте и зарисуйте мазки - препараты различных форм бактерий: круглые (стафилококк, сарцина, стрептококк), палочковидные (кишечная палочка, стрептобациллы), извитые (вибрионы). К рисункам сделайте подписи: название бактерии, способ окраски, увеличение микроскопа.

2.Заполните в рабочей тетради таблицу: «Место микробов среди других живых существ».

3.Опыт окраски по Граму в модификации Синёва.

Цель опыта: определить, имеет ли метод Грама преимущество перед простым методом и в чём оно состоит; определить, в каких случаях целесообразно применение этого метода.

Материалы: стафилококки (грамположительные бактерии) и кишечные палочки (грамотрицательные бактерии).

Ход опыта: приготовить 2 одинаковых мазка из смеси стафилококков и кишечных палочек; один мазок окрасить водным фуксином, другой - по Граму в модификации Синёва. Микроскопировать.

Результат: 2 рисунка и описание их.

Вывод: содержит ответы на вопросы, поставленные в цели опыта.

13

4. Опыт окраски по Цилю-Нильсену.

Цель опыта: определить, имеет ли метод Циля-Нильсена преимущество перед простым методом и в чём оно состоит; определить, в каких случаях целесообразно применение этого метода.

Материалы: 2 одинаковых мазка из смеси туберкулёзной палочки (кислотоустойчивые бактерии) и кишечной палочки (кислотоподатливые бактерии).

Ход опыта: окрасить один мазок простым способом (метиленовой синью), другой - по Цилю-Нильсену. Микроскопировать.

Результат: 2 рисунка и описание их.

Вывод: содержит ответы на вопросы, поставленные в цели опыта.

Занятие 2 Виды микроскопии. Структура бактериальной клетки

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения материала необходимо знать:

-структуру бактериальной клетки;

-освоить принцип тёмнопольной, фазово-контрастной, люминесцентной

иэлектронной микроскопии.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала темы необходимо вспомнить:

-принципы классификации микроорганизмов;

-основные размеры и формы бактерий;

-назначение сложных методов окраски;

-устройство и принцип работы тёмнопольного и фазово-контрастного микроскопов;

-устройство и принцип работы люминесцентного микроскопа;

-устройство и принцип работы электронного микроскопа.

Цель занятия

1.Отметить различия в строении и химическом составе прокариотов и эукариотов.

2.Ознакомиться с основными методами сложной окраски, применяемыми для выявления структурных элементов бактерий.

План изучения темы

1.Принципы классификации микроорганизмов. Основные формы бактерий и назначение сложных методов окраски (повторить).

2.Постоянные структурные элементы бактериальной клетки.

3.Непостоянные структурные элементы.

4.Биологическая роль структурных элементов бактериальной клетки, методы их выявления.

14

5.Устройство и принцип работы тёмнопольного, фазово-контрастного, люминесцентного, электронного микроскопов.

После изучения темы студент должен уметь

1.Выявлять структурные элементы бактериальной клетки.

2.Дифференцировать микроорганизмы в зависимости от наличия или отсутствия структурных элементов.

Дополнительный материал к занятию. Микроскопия «раздавленной» и «висячей» капли

Поднять конденсор до уровня предметного столика и, глядя на верхнюю поверхность конденсора, осветить поле зрения. Слегка опустить конденсор, установить объектив на x40. Поместить препарат на предметный столик. Под контролем глаза, внимательно, глядя сбоку, опустить макровинтом тубус так, чтобы объектив оказался как можно ближе к покровному стеклу препарата, но не соприкасался с ним. Глядя в окуляр, поднимать макровинтом тубус до появления в поле зрения движущихся бактерий. Ни в коем случае не опускать макровинтом тубус, глядя в окуляр.

Микроскопия «висячей» капли отличается от предыдущего способа тем, что сначала надо при малом увеличении x8 отыскать каплю, причём удобнее найти край капли, а потом передвинуть препарат так, чтобы капля заняла всё поле зрения. После этого установить большое увеличение x40 и дальше продолжать так же, как при предыдущем способе.

Контрольные вопросы

Принципы классификации микроорганизмов. Укажите основные признаки, по которым эукариоты отличаются от прокариотов. Укажите группы микроорганизмов, которые относятся к прокариотам, эукариотам; назовите неклеточные формы. Перечислите структурные элементы бактериальной клетки: постоянные и непостоянные. Какие из структурных элементов зависят от условий существования бактерий? Клеточная стенка, её биологическая роль, строение. Каковы особенности клеточной стенки грамотрицательных и грамположительных бактерий, какое значение имеют эти различия? С помощью каких веществ можно разрушить клеточную стенку? Как называются бактерии, лишённые клеточной стенки - полностью, частично? Цитоплазматическая мембрана: где располагается, биологическая роль, в каких процессах участвует? Внешняя мембрана грамотрицательных бактерий, её значение. Мезосомы: что это такое, где они располагаются, какова их биологическая роль. Нуклеоид бактерий: химическая природа, биологическая роль. В чём сходство и различие нуклеоида бактерий и ядра эукариот? Что такое плазмиды, где они располагаются, биологическая роль. Рибосомы, их локализация в клетке, биологическая роль. Капсула бактерий: биологическая роль, что собой представляет? Какие патогенные бактерии образуют капсулу только в организме хозяина (человека или животного)? Какие бактерии называют капсульными?

15

Биологическая роль спор бактерий. У каких морфологических форм споры встречаются чаще всего, очень редко, не встречаются? Процесс образования споры, условия и время, необходимые для этого. Процесс прорастания вегетативных форм бактерий и спор, условия и время, необходимые для этого. Чем объясняется устойчивость спор к внешним воздействиям? Как могут располагаться споры в клетке бактерии? Назовите виды бактерий с различным расположением спор. Латинские названия спорообразующих палочковидных форм бактерий. Способ окраски спор. Жгутики бактерий - биологическая роль. Как разделяются бактерии по количеству и расположению жгутиков? Почему жгутики не видны в обычных препаратах? Как можно увидеть жгутики бактерий? Как можно косвенным образом судить о наличии жгутиков у бактерий, какие препараты для этого готовят? Можно ли без помощи микроскопа определить наличие жгутиков у бактерий? Внутриплазматические включения у бактерий - биологическая роль. Приведите пример, у каких патогенных бактерий встречаются, как называются, каким способом окрашиваются? Ворсинки (пили, фимбрии) бактерий, где располагаются? Название ворсинок первого типа, примерное число их у клетки, биологические функции. Название ворсинок второго типа, примерное число ворсинок, биологическая роль. Что такое L-формы бактерий, чем они отличаются от исходных форм?

Устройство и принцип работы микроскопов: тёмнопольного, фазовоконтрастного, люминесцентного, электронного.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Заполните таблицу в рабочей тетради «Структура бактериальной клетки»

Работа студента на практическом занятии

1.Споры бактерий. Промикроскопируйте и зарисуйте мазок из культуры бацилл, окрашенный по способу Ожешки, споры на рисунке укажите стрелкой.

2.Капсулы бактерий. Промикроскопируйте и зарисуйте препарат из культуры капсульной бактерии, окрашенный по способу Бурри-Гинса; капсулы на рисунке укажите стрелкой.

3.Включения бактерий. Промикроскопируйте и зарисуйте мазки из культуры дифтерийной палочки (Сorynebacterium diphtheriae).

4.Жгутики бактерий и подвижность. Приготовьте и промикроскопируйте препараты «раздавленной» и «висячей» капли. Посмотрите пробирки с полужидкой питательной средой, засеянной подвижными и неподвижными бактериями; зарисуйте и дайте объяснение. Промикроскопируйте и зарисуйте препарат из культуры подвижных бактерий, укажите способ окраски и объясните, почему жгутики стали видимы в световом микроскопе.

5.Посмотрите таблицы и слайды с электронограммами бактерий, найдите

вних отдельные структурные элементы.

16

Занятие 3 Морфология и ультраструктура отдельных групп микроорганизмов:

простейших, грибов, спирохет, актиномицетов, микоплазм, риккетсий, хламидий

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения материала необходимо знать морфологию и ультраструктуру простейших, грибов, спирохет, актиномицетов, микоплазм, риккетсий, хламидий, методы изучения этих групп микроорганизмов, уметь написать по-латыни названия патогенных представителей перечисленных групп микробов.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала данной темы необходимо знать: структуру бактерий.

Цель занятия

1.Отметить особенности строения и морфологии микроскопических грибов, актиномицетов, спирохет, простейших и микоплазм.

2.Отметить особенности строения и морфологии риккетсий, хламидий.

3.Познакомиться с методами изучения морфологии этих микроорганизмов.

План изучения темы

1.Микроскопические грибы: положение в систематике организмов, морфология, структура, патогенные представители, применение в микробиологической промышленности.

2.Простейшие: положение в систематике организмов, морфология, патогенные представители.

3.Спирохеты: положение в систематике организмов, морфология, классификация, патогенные представители.

4.Актиномицеты: положение в систематике организмов, морфология, применение в качестве продуцентов антибиотиков, гормонов; патогенные представители.

5.Микоплазмы: положение в систематике микроорганизмов, особенности морфологии.

6.Риккетсии: положение в систематике микроорганизмов, особенности морфологии.

7.Хламидии: положение в систематике микроорганизмов, особенности морфологии.

После изучения темы студент должен уметь

Дифференцировать основные группы изучаемых микроорганизмов по особенностям их строения в готовых микропрепаратах.

17

Контрольные вопросы

Положение микроскопических грибов среди микроорганизмов. Особенности строения грибов, гифы, мицелий, споры. Способы размножения. Структура клеток. Морфология плесневых грибов, различие в строении мицелия и плодовых тел разных родов плесеней. Значение плесеней в жизни человека. Морфологические особенности дрожжей, отличие их от других грибов. Значение дрожжевых грибов для человека. Морфологические особенности дрожжеподобных грибов рода Кандида. Сходство и отличие от дрожжевых грибов. Значение дрожжеподобных грибов в патологии. Дерматомицеты, их морфология. Положение простейших среди микроорганизмов. Строение клетки. Патогенные представители. Положение спирохет среди микроорганизмов, морфология, схема строения. Патогенные представители и нормальные обитатели организма человека. Как изучают морфологию спирохет? Положение актиномицетов среди микроорганизмов. Сходство их с бактериями и грибами и отличие. Способы размножения. Значение в жизни человека. Микоплазмы, их положение в систематике микроорганизмов. Особенности строения и связанное с этим отношение к антимикробным средствам. Сходство с L-формами и отличие.

Положение риккетсий среди микробов, сходство их с бактериями, сходство с вирусами и отличие; морфологические формы; патогенные представители, способы окраски. Хламидии: положение среди микроорганизмов, особенности морфологии, патогенные представители.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Напишите по-латыни названия патогенных представителей спирохет, микроскопических грибов, микоплазм; названия заболеваний, вызываемых простейшими (по-русски).

Работа студента на практическом занятии

1.Морфология грибов. Промикроскопируйте мазок из культуры дрожжеподобного гриба рода Candida, окрашенный метиленовой синью. Найдите поле зрения, где хорошо виден псевдомицелий, зарисуйте.

2.Морфология простейших. Промикроскопируйте и зарисуйте мазок крови больного малярией, окрашенный по Романовскому-Гимза; сравните с таблицей и определите стадии развития обнаруженных в препарате плазмодиев. Промикроскопируйте и зарисуйте токсоплазмы в брюшинном экссудате мыши (окраска по Романовскому-Гимза).

3.Морфология спирохет. Промикроскопируйте и зарисуйте мазок крови больного возвратным тифом, окрашенный по Романовскому-Гимза; сравните с таблицей. Промикроскопируйте и зарисуйте препарат бледная трепонема в материале из твёрдого шанкра (окраска по Романовскому-Гимза), сравните с таблицей. Промикроскопируйте препарат живых лептоспир в тёмном поле зрения.

4.Морфология актиномицетов. Промикроскопируйте и зарисуйте препарат и культуры актиномицетов (окраска водным фуксином).

18

5.Морфология микоплазм. Повторите особенности строения микоплазм по таблице.

6.Морфология риккетсий. Промикроскопируйте и зарисуйте мазок из культуры риккетсий Провачека (окраска по Здродовскому); сравните с таблицей, определите, какие это формы.

7.Морфология хламидий. Промикроскопируйте и зарисуйте препарат хламидий в клетке эпителия конъюнктивы, укажите стрелками элементарные и ретикулярные тельца.

Занятие 4 Итог «Морфология микробов»

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения материала необходимо знать структуру, морфологию и названия патогенных представителей всех изученных групп микробов, историю развития микробиологии, вирусологии, иммунологии.

Исходный уровень знаний

Знать морфологию и структуру изученных ранее групп микробов.

Цель занятия

1.Систематизировать знания по истории микробиологии и морфологии микробов.

2.Продемонстрировать овладение умениями, полученными при изучении морфологии микробов.

План изучения темы

Структура бактериальной клетки. Морфология бактерий, спирохет, простейших, актиномицетов, микроскопических грибов, микоплазм, хламидий, риккетсий. Методы приготовления препаратов для микроскопии. Методы микроскопии.

После изучения раздела студент должен уметь

1.Готовить фиксированные препараты из культур микроорганизмов, растущих на плотных питательных средах.

2.Окрашивать препараты простыми методами, а также по Граму (в модификации Синёва) и Цилю-Нильсену.

3.Дифференцировать микроорганизмы по морфологическим, тинкториальным свойствам и интерпретировать полученные результаты.

4.Выявлять структурные элементы бактериальной клетки, дифференцировать микроорганизмы в зависимости от наличия или отсутствия структурных элементов.

5.Дифференцировать основные группы изучаемых микроорганизмов по особенностям их строения в готовых микропрепаратах.

Рекомендуется изучить одну тему последовательно по учебнику, по конспекту лекций, по практическому руководству, затем в таком же порядке

19

изучить следующую тему; названия патогенных представителей написать, схемы классификаций микробов начертить. Проверить свои знания по контрольным вопросам.

Контрольные практические задачи по разделу «Морфология микробов»

1.Микроскопировать и зарисовать окрашенный препарат, ответить на вопросы: название микроба, каким способом окрашен препарат, каким красителем. К каким микробам (эукариотам или прокариотам) и к какой группе относится данный микроб? Какую форму имеет? Перечислить постоянные структурные элементы данного микроба.

2.Приготовить препарат - мазок из культуры микроба, окрасить его простым способом, микроскопировать. Описать этапы приготовления препарата. Какой микроб обнаружен, к какой группе он относится, какую форму имеет?

3.Приготовить препарат - мазок из культуры микроба, окрасить его по Граму в модификации Синёва, микроскопировать. Какой микроб обнаружен, к какой группе относится, какую форму имеет, как окрашивается по Граму, в какой цвет и почему?

4.Приготовить мазок из смеси двух микробов, окрасить его по Граму в модификации Синёва, микроскопировать. Какие микробы обнаружены (название, к какой группе микроорганизмов относятся, какую форму имеют), как окрашиваются по Граму, в какой цвет?

5.Окрасить по Цилю-Нильсену готовый фиксированный препарат, микроскопировать. Какие микробы обнаружены (отдельно о каждом): название,

ккакой группе микроорганизмов относится, какую форму имеет, как относится

кокраске по Цилю-Нильсену, в какой цвет окрашивается?

6.Приготовить препарат «раздавленной» капли для определения подвижности микроба, микроскопировать, продемонстрировать преподавателю; описать этапы приготовления и микроскопии препарата.

Контрольные вопросы по разделу «Морфология микробов» (подробную расшифровку вопросов смотрите в занятиях 1-3)

1.Определение предмета микробиологии, отрасли, задачи медицинской микробиологии.

2.Методы исследования в микробиологии.

3.Значение микробиологии в работе провизора.

4.Основные этапы развития микробиологии.

5.Луи Пастер, его открытия в области микробиологии.

6.Работы Роберта Коха, их значение в области микробиологии.

7.Роль отечественных учёных в развитии микробиологии.

8.Место микроорганизмов среди других живых существ, основные группы микроорганизмов.

9.Световой микроскоп с иммерсионным объективом, правила работы с

ним.

10.Микроскопия в тёмном поле зрения.

20