107-15

Поэтому необходим контроль. Контроль проводится в соответствии с Государственной фармакопеей (XII издание, 2010).

Лекарственные средства, стерилизуемые в процессе производства, испытывают на стерильность, а инъекционные растворы - также и на пирогенность.

Лекарственные средства, не стерилизуемые в процессе производства, могут быть контаминированы микроорганизмами и поэтому должны быть испытаны на микробную чистоту.

Исследование лекарственных средств, стерилизуемых в процессе производства

Лекарственные средства для инъекций, глазные капли, мази, плёнки, другие лекарственные средства, в отношении которых имеются соответствующие указания в нормативно-технической документации (НТД), должны быть стерильными.

Отбор образцов для анализа. Число образцов из каждой серии от 3 до 40, в зависимости от метода стерилизации, для автоклавированных средств - 10. Для исследования лекарственные средства должны быть приготовлены в виде растворов, суспензий или эмульсий.

Определение антимикробного действия лекарственного средства. Во избежание неправильной оценки результатов анализа необходимо определить однократно для каждого наименования лекарственного средства обладает ли оно антимикробным действием.

Для определения антимикробного действия из ампулы с лекарственным средством следует внести по 1 мл в 3 пробирки с 10 мл тиогликолевой среды и в 1 пробирку с 10 мл жидкой соево-казеиновой среды или среды Сабуро. Для контроля в 3 пробирки с тиогликолевой средой и в пробирку с 10 мл жидкой соево-казеиновой среды или среды Сабуро вносится по 1 мл стерильной дистиллированной воды (табл.).

Затем во все пробирки следует внести по 0,1 мл взвеси тест-штамма, содержащего 1000 клеток в 1 мл. В пробирки с тиогликолевой средой вносятся штаммы Staphylococcus aureus; Bacillus subtilis; Escherichia coli; в пробирки с соево-казеиновой средой или средой Сабуро - Candida albicans. Посевы в тиогликолевой среде инкубируют при 30-35ºС в течение 2 суток, а на соевоказеиновой среде, или среде Сабуро, - при 20-25ºС в течение 3 суток.

При отсутствии антимикробного действия лекарственного средства в опытных и контрольных пробирках должен наблюдаться рост перечисленных тест-микробов. В этом случае можно продолжать исследование и провести прямой посев данного лекарственного средства на стерильность.

41

Таблица

Определение антимикробного действия лекарственных средств

При наличии антимикробного действия устраняют его. Для этого используют:

1.Соответствующие инактиваторы, указанные в частных фармакопейных статьях (например, пара-аминобензойная кислота для сульфаниламидов, пенициллиназа - для пенициллинов и цефалоспоринов).

2.При отсутствии соответствующего инактиватора препарат при посеве разводят, увеличивая объём питательной среды до 250 мл.

3.Если при этом сохраняется антимикробное действие лекарственного средства, для посева используют метод мембранной фильтрации.

Контрольные вопросы

Какие объекты в аптеках подвергаются микробиологическому исследованию? Кто проводит эти исследования? Расскажите обо всех исследуемых объектах: отбор проб, методика исследования, какие показатели определяются, какие требования предъявляются?

Каковы источники и пути загрязнения микробами растительного лекарственного сырья? Правила хранения лекарственного сырья. Чем опасно микробное обсеменение лекарств? На какие категории делятся лекарственное сырьё в зависимости от требований к их микробной чистоте? Исследования лекарственных средств, стерилизуемых в процессе производства: какие показатели определяются? Для чего проводится предварительное определение антимикробной активности лекарственных средств? Как оно проводится, с какими тест-микробами, на каких питательных средах, как оценивается результат? Что нужно сделать при наличии антимикробного действия, какими способами?

Задания на самостоятельную работу

1.Заполните таблицу в рабочей тетради: «Микробиологический контроль

ваптечных учреждениях».

2.Заполните таблицу в рабоче тетради «Исследование антимикробной активности лекарственного средства».

42

Работа студента на практическом занятии

1.Исследование воздуха аптечных помещений. Проведите исследование воздуха в учебной лаборатории с помощью аппарата Кротова.

2.Исследование дистиллированной воды, предназначенной для приготовления инъекционных растворов и глазных капель:

а) исследование количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных бактерий и грибов;

б) количественное определение БГКП в 1 мл воды.

3.Исследование смыва с аптечной посуды.

4.Исследование смыва с рук.

5.Микробиологическое исследование лекарственных средств (начало): произведите посев лекарственного средства, стерилизуемого в процессе

производства на определение антимикробной активности.

Занятие 10 Санитарно-микробиологический контроль в фармацевтических

учреждениях. Микробиологический контроль лекарственного сырья и готовых лекарственных средств (окончание)

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения материала необходимо знать принципы микробиологического исследования лекарственного сырья и лекарственных средств.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала необходимо повторить:

-способы определения ферментативной активности микробов и учёта результатов;

-методы санитарно-бактериологического исследования воды и воздуха;

-способы оценки определения антимикробного действия лекарственных средств.

Цель занятия

Освоить:

-методы микробиологического исследования лекарственных средств, стерилизуемых в процессе производства;

-методы микробиологического исследования лекарственных средств, не стерилизуемых в процессе производства.

План изучения темы

1.Микробиологический контроль в аптечных учреждениях.

2.Микрофлора лекарственного сырья и готовых лекарственных средств.

3.Микробиологические исследования лекарственных средств.

43

После изучения темы студент должен уметь

1.Проводить микробиологическое исследование готовых лекарственных средств, стерилизуемых в процессе производства.

2.Проводить микробиологическое исследование лекарственных средств, не стерилизуемых в процессе производства.

Дополнительный материал к занятию Посев лекарственных средств на стерильность (метод прямого

посева).

Испытуемый препарат, если необходимо, растворяют в соответствующем растворителе и высевают в количествах, указанных в таблице.

Количество испытуемого препарата для посева в зависимости от объёма содержимого одной единицы (ампул, флаконов), составляющих серию.

* - Если объём содержимого единицы превышает 100 мл, предпочтительнее использовать метод мембранной фильтрации.

Посевы с тиогликолевой средой инкубируют при температуре от 30 до 35ºС, а в соево-казеиновой среде, или среде Сабуро, - от 20 до 25ºС. Продолжительность инкубации посевов в обеих питательных средах составляет 14 суток. Если во всех посевах роста нет, лекарственный препарат стерилен.

Метод мембранной фильтрации. При определении стерильности лекарственных средств, обладающих антимикробным действием, и лекарственных средств, разлитых в ёмкости больше 100 мл, используют метод мембранной фильтрации. Лекарственное средство фильтруют в асептических условиях через 2 стерильных мембранных фильтра, затем смывают 3-4 порциями по 100 мл физ. раствора. Каждую мембрану стерильными ножницами разрезают пополам, половину помещают в тиогликолевую среду, половину - в жидкую соево-казеиновую среду, или среду Сабуро.

Посевы выдерживают в термостате при тех же температурах в течение 7 суток при ежедневном просмотре. Для контроля полноты смывания другую мембрану разрезают пополам и по половине мембраны помещают в питательные среды, куда засевают тест-микробы: Staphylococcus aureus и Candida albicans. Наличие роста этих микробов после инкубации в термостате указывает на полноту смывания. Для контроля стерильности условий фильтрования производят фильтрование растворителя, и фильтры засевают в те же питательные среды.

Испытание на пирогенность проводится путём введения кроликам (3) в краевую вену уха воды или лекарственного средства с измерением ректальной

44

температуры 3 раза с интервалом 1 час. При этом строго соблюдаются условия, исключающие возможность повышения температуры тела кроликов от случайных причин.

Воду или раствор лекарственного вещества считают непирогенным, если после введения ни у одного из 3 подопытных кроликов ни при одном из трёх измерений не наблюдалось повышение температуры более чем на 0,6°С по сравнению с исходной температурой и в сумме повышение температуры у 3 кроликов не превышало 1,4°С. Если у одного или 2 кроликов температура повысилась более чем на 0,6°С и в сумме у 3 кроликов повышение температуры составляет более 1,4°С, испытание повторяют дополнительно на 5 кроликах; воду или раствор считают непирогенными, если сумма повышений температуры у всех 8 кроликов не превышает 3,7°С, а индивидуальное повышение температуры на 0,6°С.

О пирогенности подробнее см. раздел «Инфекция».

Исследование лекарственных средств, не стерилизуемых

впроцессе производства

Вотношении лекарственных средств, не стерилизуемых в процессе производства, проводится испытание на микробиологическую чистоту. Это испытание включает в себя количественное определение жизнеспособных бактерий и грибов, а также выявление определённых видов микроорганизмов, наличие которых недопустимо в нестерильных лекарственных средствах.

Испытание проводят в асептических условиях. Лекарственные средства, обладающие антимикробным действием, и консерванты, входящие в состав некоторых лекарственных средств, могут подавлять рост отдельных видов микроорганизмов при проведении испытаний. Во избежание неправильной оценки результатов испытания определяют действие лекарственного средства в отношении тест-микробов. Для испытания антимикробного действия лекарственного средства, не стерилизуемого в процессе производства,

применяют тест-микробы: B.subtilis, B.cereus, E.coli, S.aureus, Salmonella abony, Candida albicans, Aspergillus. Предварительно готовят разведения лекарственного средства: 1:10, 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000. В пробирки с питательными средами вносят по 1 мл каждого разведения, в контрольные пробирки – по 1 мл стерильной дистиллированной воды. Затем во все пробирки вносят по 0,1 мл микробной взвеси тест-штамма. При обнаружении антимикробного действия лекарственного средства устраняют его и после этого производят посев на микробиологическую чистоту. При отсутствии антимикробного действия производят прямой посев.

Количественное определение бактерий и грибов проводят двухслойным агаровым методом в чашках Петри.

Определение общего числа бактерий. Испытуемый раствор вносят по

1 мл в каждую из 2 пробирок с 4 мл расплавленного и охлаждённого до 45-50°С МПА. Быстро перемешивают содержимое каждой пробирки и переносят в чашку Петри, содержащую 15-20 мл застывшего агара. Быстрым, осторожным покачиванием чашки Петри равномерно распределяют верхний слой агара.

45

После застывания среды чашки Петри переворачивают и инкубируют в течение 5 суток при 30-35ºС. Через 48 часов и окончательно через 5 суток подсчитывают количество бактериальных колоний на 2 чашках, вычисляют среднее значение и таким образом находят число бактерий в 1 мл образца.

Определение общего числа грибов. Испытание проводят двухслойным агаровым методом, используя плотную среду Сабуро. Инкубируют посевы при 20-25ºС. Через 72 часа и окончательно через 5 суток подсчитывают общее число колоний дрожжевых и плесневых грибов на 2 чашках, находят среднее значение.

Выявление и идентификация видов микроорганизмов, наличие которых недопустимо в нестерильных лекарственных средствах: бактерий семейства

Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.

Выявление и идентификация бактерий семейства Enterobacteriaceae.

Образец испытуемого лекарственного препарата в количестве 10 мл вносят в 100 мл лактозного бульона, перемешивают и инкубируют при 30-35ºС в течение 2-5 часов. Затем из этой смеси 10 мл переносят в 100 мл среды обогащения. Оставшуюся смесь в лактозном бульоне оставляют в холодильнике. Посев в среде обогащения инкубируют при 30-35ºС в течение 18-24 часов. При отсутствии роста считают, что в препарате не содержатся бактерии семейства Enterobacteriaceae.

При наличии роста исследование продолжают. Определяют следующие показатели:

а) наличие видов Salmonella;

б) наличие Escherichia coli;

в) количество энтеробактерий (кроме Salmonella и Escherichia coli). Испытание на виды Salmonella проводят путём высевания из среды

обогащения на чашки с висмут-сульфит агаром. На этой среде Salmonella образуют чёрные колонии с металлическим блеском, при этом участок среды под колонией прокрашивается в чёрный цвет. Подозрительные колонии микроскопируют, отсевают на среду Олькеницкого и ставят тест на цитохромоксидазу.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидазой, не ферментирующие сахарозу и лактозу и выделяющие сероводород, считают, что лекарственное средство контаминировано (заражено) бактериями рода Salmonella.

Испытание на Escherichia coli проводят путём высева из среды обогащения на чашку со средой Эндо. Подозрительные колонии красного цвета микроскопируют и при наличии грамотрицательных палочек делают пересев в пробирке с цитратным агаром Симмонса, на котором определяют утилизацию цитрата натрия по изменению цвета среды с зелёного на синий. Наличие индола определяют путём посева в питательный бульон.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидазой, не утилизирующие цитрат натрия и образующие индол, считают, что лекарственное средство контаминировано Escherichia coli.

46

Количественное определение энтеробактерий (кроме Salmonella и

Escherichia coli). Смесь в лактозном бульоне (из холодильника) в объёме 10 мл, 1 и 0,1 мл (что соответствует 1,0 и 0,1 г и 0,01 г препарата) засевают в среду обогащения, инкубируют при 30-35ºС в течение 18-24 ч. В случае роста делают пересев на чашку со средой Эндо и по появлению типичных колоний грамотрицательных бактерий устанавливают наличие энтеробактерий в определённом объёме препарата.

Выявление и идентификация Pseudomonas aeruginosa и

Staphylococcus aureus.

Образец в количестве 10 мл вносят в 100 мл среды обогащения, перемешивают и инкубируют при 30-35ºС в течение 24-48 часов. При наличии роста пересевают на чашку со средой для выявления пиоцианина и на чашку среды с маннитом. После инкубации в термостате отбирают подозрительные колонии.

Идентифицируют Pseudomonas aeruginosa по морфологии (грамотрицательные неспорообразующие палочки), по специфическому запаху и сине-зелёному пигменту, наличию фермента цитохромоксидазы.

Staphylococcus aureus идентифицируют по морфологии (грамположительные кокки), по сбраживанию маннита в анаэробных условиях, по реакции плазмокоагуляции.

Контрольные вопросы

Исследование лекарственных средств, стерилизуемых в процессе производства. Как производится посев на стерильность: в каких количествах, на какие питательные среды, условия и время инкубации, оценка результатов. Что такое пирогенность воды и лекарственных средств, отчего она может возникнуть? Почему наличие пирогенности инъекционных растворов недопустимо? Каким способом определяют пирогенность воды и лекарственных средств? Исследование лекарственных средств, не стерилизуемых в процессе производства: какие показатели определяются? Методика определения общего количества бактерий, общего количества грибов. Наличие, каких микробов не допускается в лекарственных средствах? Методика их выявления и идентификации.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Составьте схемы: «Ход исследования лекарственного средства, стерилизуемого в процессе производства», «Ход исследования лекарственного средства, не стерилизуемого в процессе производства».

Работа студента на практическом занятии

1. Учёт посева воздуха. Посмотрите чашки с посевами воздуха, сосчитайте количество колоний, сделайте вывод, соответствует ли воздух лаборатории по микробиологическим показателям воздуху аптечных помещений?

47

2. Исследование дистиллированной воды, предназначенной для приготовления инъекционных растворов и глазных капель. Проведите учёт посевов прошлого занятия:

а) количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных бактерий и грибов в 1 мл воды;

б) наличие БГКП в 1 мл воды (количественное определение). Сделайте вывод о пригодности воды для указанных целей.

4.Исследование смыва с аптечной посуды (продолжение). Проведите учёт результата:

а) количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных бактерий в 1 мл смывной жидкости (результат запишите);

б) результат посева на среде Эйкмана, сделайте вывод о дальнейшем ходе исследования.

5.Исследование смывов с рук (продолжение). Учтите результат посева на среде Кесслера, сделайте вывод о дальнейшем ходе исследования. Учтите результаты посева на солевом МПБ и сделайте вывод о дальнейшем ходе исследования.

6.Микробиологические исследования лекарственных средств.

а) произведите учёт результата посева лекарственного средства, стерилизуемого в процессе производства, на антимикробную активность;

б) произведите учёт готового результата посева лекарственного средства, стерилизуемого в процессе производства, на стерильность. Сделайте вывод.

7. Исследование лекарственного средства, не стерилизуемого в процессе производства:

а) произведите учёт готового результата посева лекарственного средства, не стерилизуемого в процессе производства, на антимикробную активность;

б) учтите результаты готовых посевов: определение общего количества бактерий и грибов двухслойным агаровым методом;

в) выявление и идентификация бактерий семейства Enterobacteriaceae:

-идентификация видов Salmonella. Просмотрите колонии, выросшие на чашке с висмут-сульфит агаром, приготовьте мазок, окрасьте его по Граму в модификации Синёва, микроскопируйте. Изучите изменения на среде Олькеницкого. Изучите продукцию цитохромоксидазы;

-идентификация Escherichia coli. Просмотрите колонии, выросшие на чашке со средой Эндо, приготовьте мазок, окрасьте его по Граму, микроскопируйте. Изучите утилизацию цитрата. Определите образование индола;

-количественное определение энтеробактерий. Учтите результаты посевов на чашке со средой Эндо. Подсчитайте количество энтеробактерий, исходя из разведения препарата.

г) выявление и идентификация Pseudomonas aeruginosa. Посмотрите посев на чашке, при наличии роста приготовьте мазок, окрашенный по Граму в модификации Синёва, и проведите идентификацию бактерий;

д) выявление и идентификация Staphylococcus aureus. При наличии роста на среде с маннитом отметьте изменение цвета среды (сбраживание маннита)

48

приготовьте мазок, окрашенный по Граму, проведите идентификацию бактерий. Реакцию плазмокоагуляции поставьте в начале занятия: в цитратную плазму крови, разведённую 1:5, посейте стафилококки, посев поставьте в термостат, результат учтите в конце занятия.

Занятие 11 Химиотерапевтические препараты. Антибиотики. Определение активности антибиотиков. Определение чувствительности

микроорганизмов к антибактериальным препаратам

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения материала необходимо знать:

-источники получения химиотерапевтических препаратов и антибиотиков, а также механизмы их антимикробного действия;

-методы определения активности антибиотиков;

-условия формирования лекарственной устойчивости микроорганизмов и методы её определения.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала необходимо повторить:

-морфологию и физиологию грибов и других продуцентов антибиотиков;

-участие структурных элементов клеток прокариотов в их физиологических функциях.

Цель занятия

1. Изучить:

-основные группы химиотерапевтических препаратов с антимикробной активностью;

-методы определения активности антибиотиков;

-методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам.

2. Усвоить сведения о механизмах лекарственной устойчивости бактерий.

План изучения темы

1.Основные этапы развития химиотерапии и учения об антибиотиках.

2.Основные группы антимикробных веществ: природные, полусинтетические, синтетические антимикробные агенты.

3.Источник получения, механизм действия и классификация антибио-

тиков.

4.Побочные явления при антибиотикотерапии.

5.Лекарственная устойчивость микробов.

После изучения темы студент должен уметь

Определить:

-активность антибиотиков методом диффузии в агар и методом серийных разведений;

-антибиотикограмму исследуемой культуры диско-диффузионным ме-

тодом.

49

Дополнительный материал к занятию

Критериями антимикробной активности препарата являются

минимальная ингибирующая концентрация (МИК) и минимальная бактерицидная концентрация (МБК). МИК – это наименьшая концентрация антибиотиков, которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий. Она выражается в мг/л или мкг/мл. МБК – это наименьшая концентрация антибиотика, которая вызывает бактерицидный эффект. Для её определения необходимо провести высев из пробирок, в которых визуально отсутствует рост, на плотный питательный агар, не содержащий антибиотик. Этот показатель имеет большое клиническое значение. На основе метода серийных разведений созданы микрометоды, предусматривающие использование меньшего объёма питательной среды. В настоящее время для проведения такого рода исследований выпускаются многочисленные коммерческие наборы, состоящие из высушенных стабилизированных разведений антибиотиков в питательной среде, которые разбавляются суспензией тест-микроба. Данные наборы могут храниться в обычных условиях, вследствие чего исключается необходимость в приготовлении разведений среды и антибиотиков в лабораторных условиях. Достоинством тестов микроразведений является также то, что они включаются в автоматизированную систему.

На основании полученных данных (диаметра зоны задержки роста или величины МИК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные. Для разграничения этих категорий используют так называемые пограничные концентрации антибиотиков, которые не являются неизменными величинами. Они пересматриваются по мере изменения чувствительности популяции микроорганизмов. Разработкой и пересмотром критериев интерпретации занимаются ведущие специалисты (химиотерапевты, микробиологи), входящие в специальные комитеты. Одним из них является национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам (National

Committee for Clinical Laboratory Standards – NCCLS), организованный в США.

В настоящее время стандарты NCCLS используются как международные для оценки результатов определения чувствительности бактерий при многоцентровых микробиологических и клинических исследованиях.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам. Критерием чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является минимальная ингибирующая концентрация (МИК) антибиотика, задерживающая рост возбудителя при стандартных условиях постановки опыта.

Для определения лекарственной устойчивости используют суточную чистую культуру возбудителя, выделенную из организма больного, и стандартную питательную среду (АГВ или Мюллер-Хинтон агар) для её посева.

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят диско-диффузионным методом или методом серийных разведений антибиотика в жидких или плотных средах.

Диско-диффузионный метод. Определение чувствительности к антибиотикам методом бумажных дисков основано на диффузии антибиотика в питательную среду. Концентрация антибиотиков в дисках подобрана таким

50