Загальна характеристика методів дослідження білків. Традиційні методи виділення й очищення білків

Усі методи поділу сумішей засновані на тім, що поділювані компоненти в результаті яких-небудь маніпуляцій виявляються в різних ділянках системи і можуть бути механічно відділений друг від друга.

Виділення індивідуальних білків є поетапним процесом, тому що на перших етапах очищення фракції містять безліч домішок. На кожній ступені поділу повинна виходити фракція, більш багата необхідною речовиною, чим попередня. Такий процес часто називають фракціонуванням. На кожній стадії поділу білок знаходиться або у виді розчину, або у виді осаду.

1) Осадження. Для осадження необхідно понизити яким-небудь способом розчинність білка. Розчинність білка залежить від його здатності до гідратації. У глобулярних водорозчинних білків високий рівень гідратації забезпечується розташуванням гідрофільних груп на поверхні. Додавання органічних розчинників знижує ступінь гідратації і приводить до осадження білка. В якості таких розчинників використовують ацетон. Осаджують білки також за допомогою солей, наприклад, сульфату амонію. Принцип цього методу заснований на тім, що при підвищенні концентрації солі в розчині відбувається стиск йонних атмосфер, утворених протиіонами білка, що сприяє зближенню їх до критичної відстані, на якій міжмолекулярні сили Ван-дер-ваальсова притягання переважують кулонівські сили відштовхування протиіонів. Це приводить до злипання білкових часток і їхньому випаданню в осад.

2) Ізоелектричне осадження. Заряд білків обумовлений у першу чергу залишками аспартата і глутамата (негативний заряд) і залишками лізина й аргініну (позитивний заряд). В міру підвищення рН різними способами заряд білків змінюється від позитивних до негативних значень і в ізоелектричній точці дорівнює нулю. У результаті білок позбавляється своєї іонної атмосфери і його частки сліпаються, випадаючи в осад.

3) Центрифугування. Осад білка, що випав, можна виділити фільтруванням. Для цього часто використовують центрифуги. Частки речовини під дією відцентрової сили осідають на дні центрифужних склянок і стискуються в щільний осад, з якого розчин, що залишився, (надосадова рідина) легко зливається чи відсмоктується. Швидкісні центрифуги (ультрацентрифуги) створюють відцентрове прискорення порядку 100000 прискорень вільного падіння, що дозволяє осаджувати навіть деякі великі надмолекулярні агрегати - рибосоми і віруси.

4) Сорбція. Заснована на різній спорідненості компонентів сумішей до визначених речовин сорбентам. Найбільш часто сорбент, що використовують, гель фосфату кальцію чи активоване вугілля. Ефективну сорбцію можна одержати на іонітах сорбентах, що мають на поверхні заряджені групи. У вихідному стані ці заряди скомпенсовані якими-небудь рухливими протиіонами. Практично при сорбції на іонітах відбувається обмін цих протиіонів. Якщо на поверхні сорбенту знаходяться негативно заряджені групи, то він зв'язує катіони і його називають катіонітом, відповідно сорбент із позитивно зарядженими групами називають аніонітом. Як іоніти найчастіше використовують матеріали (після відповідної хімічної обробки) на гідрофільній основі - целюлозі, декстрані чи силікагелі.

5) Ситовий ефект. Молекулярні сита являють собою матеріали з дуже маленькими порами визначеного розміру. Слід зазначити відмінність цих "сит": великі частки не залишаються на поверхні матеріалу сита, а обтікають його часточки (гранули), тоді як дрібні речовини домішок дифундують у частки сита й у такий спосіб затримуються. Матеріалом для молекулярних сит може служити сефадекс (полісахарид декстран, у якого після відповідної обробки ланцюга виявляються зшитими трьохвуглецевими містками) чи поліакриламід, лінійні ланцюги якого зшиті метиленовими містками.

У перерахованих методах у кінцевій суміші залишаються допоміжні низькомолекулярні речовини, органічні розчинники, солі і кислоти. Для очищення від них використовується метод діалізу. Діаліз заснований на застосуванні мембран, які проникні для води і низькомолекулярних речовин і непроникні для білків. Найчастіше з цією метою використовують плівки з целофану (нітрат целюлози). У лабораторії підлягаючий діалізу розчин білка вміщують у мішок з целофану і занурюють останній у судину з водою. Безупинний струм води через судину приводить до повного переходу в нього всіх минаючих скрізь целофан речовин, а білки залишаються усередині.

Методи зонального поділу засновані на тім, що створюється деяка система, у якій компоненти суміші переміщаються з різними швидкостями. Якщо в таку систему ввести поділювану суміш у виді деякої зони, то в міру її переміщення компоненти суміші, що рухаються з різними швидкостями, будуть формувати окремі зони, що потім можна рознести в різні приймачі.

1) Хроматографія. При поділі білків і їхньому аналізі використовується рідинна хроматографія. У рідинній хроматографії зона поділюваних речовин за допомогою струму елюіруючої рідини переміщається щодо нерухомої фази, що має різну спорідненість до поділюваних компонентів. При переміщенні зони за допомогою струму елюента кожний з поділюваних компонентів проводить деяку частину часу на нерухомій фазі. Чим більше цей час, тим повільніше переміщається зона з сумішшю.

У залежності від природи фізико-хімічного явища, що лежить в основі поділу речовин, розрізняють адсорбційну, йонообмінну, розподільну і гель-хроматографію (ексклюзивну хроматографію). В адсорбційній найчастіше використовують оксид алюмінію як нерухому фазу. У йонообмінній використовуються ті ж типи іонітів, що в йонообмінній сорбції. Розподільна хроматографія заснована на поділі речовин між двома рідкими фазами, що незмішуються. Нерухома рідка фаза утворюється в результаті її закріплення на пористому нерозчинному носії.

2) Електрофорез. У цьому випадку зони створюються в результаті того, що різні компоненти суміші з різною швидкістю переміщаються в електричному полі. Після спеціальної обробки суміші наносять на гель (декстроновий, поліакріламідний чи інший), а потім підключають на визначений час постійний електричний струм. Білки в залежності від своєї молекулярної маси і заряду починають рухатися з різною швидкістю. Після відключення струму гель поміщають у спеціальний розчин, де білки зафарблюються. Існує електрофорез у розчині, але він має обмежене застосування, тому що досліджувані білки часто піддаються значному дифузійному розмиванню. Однак зараз стало можливим застосовувати цей метод в умовах невагомості в космосі, що усуває конвекційні струми, що обумовлюють дифузійну розмивку.