Биохимия растений

ионов и некоторых других соединений, называемых активаторами ферментов. Роль активаторов заключается в том, что они спо-

собны переводить в активное состояние определенные груп˝пиров-

ки в каталитическом центре молекулы фермента и таким обра˝зом участвовать в каталитическом действии ферментного белк˝а. Так, протеолитические ферменты, катализирующие гидролитичес˝кое

расщепление белков, активируются HCN, H2S, а также вещества-

ми, содержащими сульфгидрильные группы (восстановленный˝ глютатион, цистеин).

Многие активаторы выполняют роль дополнительного субст˝ра-

та, который, взаимодействуя с истинным субстратом, переводит его в активное состояние и таким образом ускоряет образов˝ание

фермент-субстратного комплекса. Примером такого взаимод˝ей-

ствия могут служить ферментативные реакции с участием АТФ и

ионов магния, в которых основной субстрат АТФ переводится˝ в

активное состояние путем образования комплекса с катион˝ом магния (Мg АТФ2–, ñì. ñ. 168—169).

На каталитическую активность ферментов оказывает влиян˝ие

ионный состав среды, способствующий формированию молеку˝ла-

ми фермента и субстрата специфической пространственной˝ структуры, которая позволяет этим молекулам активно взаи˝мо-

действовать, в результате увеличивается скорость образо˝вания

фермент-субстратного комплекса и происходит ускорение ф˝ерментативной реакции в целом.

Многие ферменты активируются в присутствии ионов метал-

лов. Так, катионы магния (Mg2+) являются активаторами фермента фосфопируватгидратазы, катализирующей отщепление мо˝леку-

лы воды от 2-фосфоглицериновой кислоты в процессе дыхания˝, а также ферментов, катализирующих реакции фосфорилирован˝ия, в которых происходит перенос остатков ортофосфорной кисл˝оты от АТФ на различные субстраты. Катионы кальция (Са2+) активируют растительные липазы, катализирующие гидролиз ацилгли˝церинов, и α-амилазы, ускоряющие распад крахмала. Катионы калия (К+) активируют многие ферменты углеводного обмена. Фермент˝ аргиназа, катализирующий гидролитическое расщепление а˝рги-

нина на орнитин и мочевину, повышает свою активность в при˝- сутствии катионов Со2+, Mn2+, Ni2+.

Известны также ферменты, активность которых повышается в присутствии неорганических анионов: Cl–, Βr–, I–, H2PO4–, ÍÑÎ3– и др. Так, активаторами амилаз, катализирующих гидролиз кр˝ах-

мала, служат ионы галогенов.

При изучении влияния активаторов на активность ферменто˝в было выяснено, что максимальная каталитическая активнос˝ть ферментных молекул наблюдается при определенной концен˝тра-

211

рует фермент, определенного набора

специфических активаторов, содержащихся в оптимальной к˝он-

центрации.

Ингибиторы ферментов. Это вещества, которые подавляют действие ферментов. Под влиянием ингибитора скорость фермента-

тивной реакции замедляется или ферментативное превраще˝ние

полностью прекращается. Процесс воздействия ингибитора˝ на ферментные белки называют ингибированием ферментов. Различа-

ют обратимое и необратимое ингибирование и соответствен˝но ин-

гибиторы обратимого и необратимого действия.

При обратимом ингибировании не происходит безвозвратно˝й

потери каталитической активности фермента, так как ингиб˝итор не

разрушает пространственной структуры ферментного белка и после отделения ингибитора от фермента активность последнего˝ восста-

навливается. Различают два вида ингибиторов, вызывающих о˝брати-

мое ингибирование: конкурентные и неконкурентные ингиби˝торы. Конкурентные ингибиторы — вещества, структурно родствен-

ные субстрату, вследствие чего они, как и молекулы субстра˝та,

способны связываться с одним из участков в активном центр˝е фермента, но при этом не могут подвергаться превращению п˝од

действием фермента. Молекулы фермента, связанные с ингиби˝-

тором, не могут катализировать превращение субстрата, поэтому скорость ферментативной реакции замедляется. Чем выше ко˝н-

центрация ингибитора, тем больше молекул фермента в кажды˝й

момент времени связаны с ингибитором и тем сильнее ингиби˝- рование. Поскольку субстрат и ингибитор — структурные а˝нало-

ги, в ходе реакций между ними происходит конкуренция за св˝я-

зывание с активным центром фермента, поэтому степень игиб˝и- рования ферментативного превращения зависит от соотнош˝ения концентраций субстрата и ингибитора. Если концентрация с˝уб-

страта во много раз превышает концентрацию ингибитора, то в

каждый момент лишь небольшое число молекул фермента связ˝ано с ингибитором и действие ингибитора почти не проявляется.

212

Следует отметить, что конкурентные ингибиторы не являютс˝я полными структурными аналогами субстрата, так как для свя˝зывания с ферментным белком ингибитору вполне достаточно, есл˝и он будет структурно совместим хотя бы с одним из участков св˝языва-

ния субстрата в активном центре фермента, а другая часть м˝олекулы ингибитора может существенно отличаться от молекулы с˝уб-

страта.

Хорошо изученный пример конкурентного ингибирования —

действие малоновой кислоты на фермент сукцинатдегидрог˝еназу,

катализирующий отщепление водорода от янтарной кислоты˝ в

цикле ди- и трикарбоновых кислот:

Малоновая кислота — структурный аналог субстрата — ян˝тарной кислоты, поэтому способна связываться вместо субстра˝та с

активным центром сукцинатдегидрогеназы, но подвергатьс˝я окис-

лению с образованием фумаровой кислоты малоновая кислот˝а не

может, вследствие чего молекулы фермента, связанные с мал˝оно-

вой кислотой, не участвуют в каталитическом действии и скорость превращения янтарной кислоты в фумаровую понижается. Одн˝а-

ко если в реакционную среду добавить большое количество с˝уб-

страта, т. е. янтарной кислоты, то ингибирование фермента пре-

кращается.

Фермент рибулозодифосфаткарбоксилаза, катализирующий присоединение СО2 к первичному акцептору в цикле Кальвина (см. с. 292—293), подвергается конкурентному ингибированию по-

вышенной концентрацией О2. Кислород представляет собой

структурный аналог СО2, поэтому может связываться с активным центром рибулозодифосфаткарбоксилазы и действует в это˝м слу- чае как конкурентный ингибитор.

На основе конкурентного ингибирования производится под˝бор

и синтез многих лекарственных препаратов, действие котор˝ых на-

правлено на подавление активности ферментов инфекционн˝ой микрофлоры. Использование химических препаратов в качес˝тве

ингибиторов ферментных систем возбудителей различных з˝аболе-

ваний называется химиотерапией. Для химиотерапии подбирают такие конкурентные ингибиторы, которые по структуре наиб˝олее

полно соответствуют участкам связывания субстрата в акт˝ивном

центре ферментов и поэтому обладают очень сильным ингиби˝тор-

213

ным действием. К таким сильным лекарственным средствам от˝носятся, например, сульфаниламидные препараты (белый стреп˝тоцид), которые по химической структуре близки к парааминоб˝ензойной кислоте, необходимой многим микроорганизмам как о˝дин

из компонентов для синтеза витамина — фолиевой кислоты˝.

При введении в организм человека или животных сульфанил-

амида он действует как конкурентный ингибитор микробных˝ фер-

ментов, катализирующих синтез фолиевой кислоты с участие˝м в качестве одного из субстратов ï-аминобензойной кислоты, в ре-

зультате рост клеток патогенной микрофлоры подавляется˝ вслед-

ствие недостатка этого витамина. На организмы млекопитаю˝щих сульфаниламид не действует в связи с тем, что их клетки не с˝по-

собны к синтезу фолиевой кислоты, они получают этот витам˝ин в

необходимом количестве с пищей.

Неконкурентные ингибиторы не имеют структурной аналогии с

субстратами и поэтому взаимодействуют не с участком связ˝ыва-

ния субстрата в активном центре фермента, а с другим участ˝ком ферментной молекулы, вызывая инактивацию каталитическо˝го

центра. При этом ингибитор не вступает в конкурентное вза˝имо-

действие с субстратом и не препятствует связыванию субст˝рата в активном центре фермента, однако молекула субстрата не по˝двер-

гается превращению, так как под влиянием ингибитора стано˝вят-

ся неактивными группировки фермента, которые активируют˝ суб-

страт. Поскольку при неконкурентном ингибировании субст˝рат и ингибитор связываются с разными участками молекулы ферм˝ента,

действие такого ингибитора не ослабляется при увеличени˝и кон-

центрации субстрата в физиологической среде.

К ингибиторам неконкурентного действия относятся циани˝ды,

которые подавляют активность ферментов, содержащих атом˝ы Fe

или Cu (цитохромоксидазы, фенолоксидазы и др.). Ингибитор, содержащий цианидные группировки (CN–), образует комплекс-

ное соединение с металлом, входящим в состав фермента, в ре˝-

зультате чего атом металла теряет способность участвова˝ть в каталитическом действии фермента и скорость ферментативной˝ реакции понижается; в состоянии же насыщения фермента ингибит˝о- ром она практически полностью прекращается. При удалении˝ цианида из реакционной среды каталитическая активность˝ фер-

214

мента восстанавливается. Неконкурентное ингибирование ˝могут вызывать также катионы водорода, которые вследствие малы˝х раз-

меров не препятствуют связыванию субстрата, но при соединении

с некоторыми группировками в активном центре фермента из˝меняют их электрический заряд и тем самым инактивируют ката˝литический центр.

В процессе необратимого ингибирования молекула ингибит˝ора

образует прочную ковалентную связь с одной из группирово˝к в активном центре фермента, в результате чего становится не˝воз-

можным его каталитическое действие. Поскольку образовав˝шееся

соединение ингибитора с ферментом не разрушается и не дис˝со-

циирует в условиях физиологической среды, в которой функц˝ио-

нирует фермент, каталитическая активность фермента пода˝вляется необратимо.

Многие ингибиторы, вызывающие необратимое ингибирова-

ние, обладают строго избирательным действием, так как спо˝собны

взаимодействовать только с определенными группировками˝ в ак-

тивном центре фермента. Так, многие галогенопроизводные о˝рганических веществ являются специфическими ингибиторами ˝фер-

ментов, содержащих в активном центре сульфгидрильные гру˝ппы

(SH-группы). Взаимодействие таких ингибиторов с молекулой

фермента происходит по следующей схеме:

Фермент—SH + X—R → Фермент—S—R + HX,

где Х — атомы галогенов (Cl, I, Br, F).

Фосфорорганические соединения необратимо ингибируют ферменты, имеющие в активном центре гидроксильные группы˝

аминокислоты серина. Взаимодействие одного из таких инги˝бито-

ров диизопропилфторфосфата с ферментом можно представи˝ть в

виде следующей реакции:

В результате присоединения к молекуле фермента фосфорор˝га-

нического радикала происходит блокирование активного ц˝ентра

фермента и очень сильное подавление его каталитической а˝ктивности.

Фосфорорганические ингибиторы — сильные яды, необратим˝о

ингибирующие ферменты, которые катализируют гидролиз сл˝ож-

ных эфиров холина (холинэстеразы), а также белков (серинов˝ые

протеиназы). Один из ферментов, чувствительных к указанны˝м

215

ингибиторам, — ацетилхолинэстераза, которая катализиру˝ет гидролиз ацетилхолина, образующегося в клетках нервных ткан˝ей при передаче нервных импульсов. В результате блокировани˝я активного центра ацетилхолинэстеразы фосфорорганическим˝ инги-

битором прекращается гидролиз ацетилхолина и он накапли˝вается в нервных клетках. Это нарушает передачу нервных импул˝ьсов,

что вызывает паралич и смерть организма. Такие ингибиторы˝ используют в сельском хозяйстве в качестве инсектицидов не˝рвно-

паралитического действия.

Все ферменты необратимо ингибируются катионами тяжелых˝

металлов (Hg2+, Pb2+, Ag+, Cu2+ и др.), а также галогенопроизвод-

ными уксусной кислоты (трихлоруксусная, иодуксусная кисл˝оты и др.), которые при соединении с SH-группами ферментного бел-

ка образуют нерастворимые соединения. Следует отметить, ч˝то

все факторы, вызывающие денатурацию белков, неспецифичес˝ки

подавляют действие любого фермента, так как основу его со˝став-

ляет молекула белка.

В семенах, клубнях, листьях и других органах растений выяв˝ле-

ны специфические белки с молекулярными массами от 5000 до

60 000, которые образуют с ферментами неактивные комплексы, в

результате чего происходит ингибирование ферментативны˝х реак-

ций. Такие белки называют белковыми ингибиторами ферментов. В зависимости от особенностей взаимодействия с ферментам˝и разли-

чают белковые ингибиторы эндогенного и экзогенного действия.

Белковые ингибиторы эндогенного действия образуют неак˝-

тивные комплексы с ферментами собственного организма и т˝аким

образом участвуют в регулировании определенных биохими˝ческих процессов в тканях и органах растений. Так, в процессе созр˝евания зерновок злаковых растений в них усиливается синтез б˝елко-

вых ингибиторов амилаз и протеаз, катализирующих соответ˝- ственно гидролиз крахмала и запасных белков, вследствие ч˝его к концу созревания зерновок большая часть указанных ферме˝нтов связывается с белками-ингибиторами. Благодаря такому дей˝ствию

ингибиторов в зерне происходит накопление крахмала и зап˝асных

белков.

Белковые ингибиторы экзогенного действия подавляют кат˝а- литическую активность ферментов чужеродного организма.˝ Обнаружено, что некоторые растительные белки образуют неакти˝вные

комплексы с пищеварительными ферментами насекомых, живо˝т-

ных и птиц, человека, вызывая задержку их роста. К таким инг˝и- биторам относятся некоторые альбумины, содержащиеся в зерновках злаковых и семенах бобовых растений. Они специфически˝ по-

давляют активность α-амилаз, трипсина и химотрипсина, а белок

зерна пшеницы пуротионин обладает бактерицидным и фунги˝-

цидным действием.

216

8.6.ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

Âклетках растений одновременно протекают несколько тыс˝яч

биохимических превращений, каждое из которых катализиру˝ется

одним и даже несколькими ферментами. При этом вещество, об˝-

разующееся с участием одного фермента, служит субстратом˝ для

другого, а синтезированный продукт подвергается действи˝ю тре-

тьего фермента и т. д. В результате формируется довольно с˝ложная

система взаимосвязанных биохимических превращений, в ко˝торой ферменты подвержены определенной структурной и про-

странственной организации, обеспечивающей согласованно˝е осу-

ществление реакций в соответствии с реализуемой генетич˝еской

программой развития данного органа или клетки. При этом р˝аз-

личают три типа мультиферментных систем (рис. 8.11).

Ê первому типу относятся ферментные системы, включающие

не связанные друг с другом молекулы ферментов, которые на˝хо-

дятся в растворенном состоянии в жидкой фазе клетки и кат˝али-

зируют главным образом одноэтапные биохимические реакц˝ии. В

этом случае субстраты и образующиеся из них продукты реак˝ций представляют собой низкомолекулярные вещества, характе˝ризую-

щиеся высокой скоростью диффузии, поэтому они относитель˝но

легко перемещаются от одной молекулы фермента к другой и ˝т. д.,

обеспечивая достаточно быстрое превращение внутриклето˝чных

метаболитов.

Êî второму типу мультиферментных систем принадлежит на-

бор ферментов, катализирующих серию последовательных би˝охи-

мических реакций и образующих высокомолекулярный компл˝екс,

Рис. 8.11. Мультиферментные системы:

1 — диссоциированная мультиферментная система; 2 — мультиферментный комплекс в жидкой физиологической среде; 3 — мультиферментная система, связанная с мембраной; À, Á, Â, Ã, Ä, Å — субстраты и промежуточные продукты последовательных˝ ферментативных превращений; Ф1, Ô2, Ô3, Ô4, Ô5 — молекулы ферментов

217

растворимый в жидкой фазе клетки. Каждый из ферментов в со˝- ставе этого комплекса катализирует определенный этап пр˝евращений в ходе синтеза конечного биохимического продукта, а˝ образующиеся промежуточные соединения подвергаются дейст˝вию

ферментов, не выходя из ферментного комплекса. В ходе мног˝о- этапного превращения продукт реакции, катализируемой пе˝рвым

ферментом, связывается с белком-переносчиком и последова˝тельно подвергается изменениям под действием всех ферментов˝ дан-

ного мультиферментного комплекса. Примерами таких мульт˝и-

ферментных систем могут служить комплексы ферментов, кат˝али-

зирующих окислительное декарбоксилирование пировиногр˝адной

èα-кетоглутаровой кислот или синтез жирных кислот.

Êтретьему типу относятся мультиферментные системы, свя-

занные с мембранами внутриклеточных структур. Отдельные˝ фер-

менты этой системы являются структурными элементами кле˝точ-

ной мембраны и, занимая в ней упорядоченное положение, мог˝ут

катализировать последовательные биохимические превращ˝ения, происходящие на поверхности мембран, или участвовать в пр˝о-

цессах трансмембранного переноса веществ и ионов. К таког˝о

типа системам относятся ферментные системы, связанные с м˝емб-

ранами митохондрий и хлоропластов и катализирующие соот˝вет-

ственно процессы окислительного и фотосинтетического ф˝осфорилирования.

Как видно из характера построения, ферментные системы тре˝-

тьего типа строго локализованы, так как связаны с мембран˝ами

различных клеточных структур. Однако в ходе исследований уста-

новлено, что ферменты, образующие системы первого и второ˝го типа, также локализованы в клетке, так как находятся в межм˝ембранных отсеках (компартментах) эндоплазматического рети˝кулу-

ма или внутриклеточных органелл, вакуолях, микротельцах, лизосомах. Поступление субстратов в указанные компартмент˝ы и выход из них продуктов реакций происходит через мембраны˝, проницаемость которых регулируется гормонами и рецепто˝рными

белками. Сами же ферменты, являясь крупными белковыми мол˝е-

кулами, не могут диффундировать через мембраны, поэтому и˝х действие строго ограничено пространством конкретного к˝омпартмента.

Активность биохимических процессов в клетке регулирует˝ са-

мая крупная ее органелла — ядро, которое является носите˝лем ге-

нетической (наследственной) информации, содержащейся в м˝олекулах ДНК. Значительная часть этой информации — это посл˝едовательности нуклеотидных остатков, кодирующие структуры бел-

ков-ферментов, а также рибосомной, транспортной и матричн˝ой

РНК, участвующих в синтезе белков. Молекулы ДНК в комплекс˝е

с ядерными белками гистонами упакованы в виде хроматина,

218

окруженного коллоидным раствором, называемым нуклеопла˝змой или ядерным матриксом. В нуклеоплазме растворены фермент˝ы и ферментные комплексы, катализирующие внутриядерные био˝химические реакции синтеза и репарации ДНК, синтеза всех ви˝дов

РНК, образования субчастиц рибосом и др.

Основная часть внутриклеточного пространства заполнена˝ ци-

тозолем, представляющим жидкую часть цитоплазмы, в которо˝й сосредоточены органеллы и другие внутриклеточные струк˝туры. В

цитозоле в растворенном состоянии находятся ферменты и ф˝ер-

ментные комплексы, катализирующие реакции гликолиза и пр˝е-

вращения моносахаридов, гидролиза различных веществ, син˝теза

олигосахаридов, жирных кислот, нуклеотидов и некоторых ам˝и- нокислот. В межмембранных отсеках гладкого эндоплазмати˝чес-

кого ретикулума локализованы ферменты, катализирующие с˝ин-

тез липидов, а в мембранных структурах шероховатого эндоп˝лаз-

матического ретикулума — ферменты, катализирующие синт˝ез

гликопротеидов и осуществляющие модификационные измене˝- ния белковых молекул.

Âмитохондриях функционируют ферментные системы, ката-

лизирующие реакции аэробного дыхания и окислительного ф˝ос-

форилирования. Во внутренних мембранах митохондрий лока˝ли-

зованы переносчики электронов и протонов дыхательной це˝пи, а также ферменты АТФ -синтетазного комплекса. Во внутреннем

матриксе митохондрий находятся ферменты, катализирующи˝е ре-

акции цикла Кребса и β-окисления жирных кислот, глутаматде-

гидрогеназа и другие ферменты, катализирующие реакции во˝сста-

новительного аминирования кетокислот. В матриксе митохо˝ндрий локализованы также многие аминотрансферазы, катализ˝ирующие реакции переаминирования.

Âмембранных структурах хлоропластов содержатся перено˝счи- ки электронов и протонов, а также ферментные системы, ката˝лизирующие фотохимические реакции и реакции фотосинтетич˝еского фосфорилирования, в ходе которых происходит поглоще˝ние

световой энергии и ее использование для синтеза АТФ и вос˝ста-

новленных динуклеотидов НАДФ · Н. В жидкой фазе хлоропла˝с- тов, называемой стромой, растворены ферменты цикла Кальви˝на, изомеразы моносахаридов и их производных, фосфотрансфер˝азы, гликозил- и нуклеотидилтрансферазы, ферменты синтеза оли˝госа-

харидов. В хлоропластах локализованы также ферменты синт˝еза

крахмала, липидов и белоксинтезирующей системы. В хромопл˝астах представлены наборы ферментов, катализирующих синте˝з различных пигментов, в лейкопластах — ферменты синтеза зап˝асных

веществ: крахмала, жира, белков.

Âцитоплазме клеток имеются также небольшие органеллы,

ограниченные простой одинарной мембраной и содержащие фер-

219

мент каталазу и определенные наборы других ферментов. В к˝летках листьев такие органеллы называют пероксисомами, а в запасающих клетках семян — глиоксисомами. Установлено, что в пероксисомах содержится набор ферментов, катализирующих реа˝к-

ции фотодыхания, а в глиоксисомах — ферменты глиоксилат˝ного цикла.

Особую функцию выполняют рибосомы. Они представляют собой каталитически активные клеточные органеллы, осущест˝вляю-

щие синтез белков. Все структурные компоненты рибосом в т˝ой

или иной степени предназначены для выполнения основной к˝ата-

литической функции — соединение в определенной последо˝ва-

тельности аминокислотных остатков в соответствии с посл˝едовательностью кодонов в структуре мРНК. В субчастицах рибосо˝м

содержатся также ферментные белки, являющиеся факторами˝

инициации, элонгации и терминации в процессе синтеза поли˝-

пептидной цепи.

Ферменты, локализованные в мембранных структурах аппара˝та Гольджи, катализируют реакции гликозилирования белков (п˝ри-

соединение к белкам олигосахаридного радикала); синтез п˝олиса-

харидов, образующих матрикс клеточной стенки, а также вос˝ка и

полисахаридов, секретируемых на поверхность листьев, сем˝ян,

плодов.

Âвакуолях растительных клеток могут содержаться гидрол˝ити-

ческие ферменты. Таким образом, большинство происходящих˝ в

клетке биохимических реакций строго локализовано во вну˝три-

клеточном пространстве, так как катализирующие их фермен˝ты

или связаны с определенными мембранными структурами, или˝ функционируют в ограниченных мембранами компартментах ˝цитоплазмы и различных внутриклеточных органелл.

С помощью секреторных механизмов, в которых участвует мембранный комплекс аппарата Гольджи, растительные клет˝ки могут выделять некоторые ферменты в окружающее простран˝ство. Об этом свидетельствуют исследования культуры изолированных

органов, тканей и клеток растений. Особенно важное значен˝ие

имеет выделение ферментов на поверхности клеток корнево˝й системы растений. Таким образом растение может оказывать вли˝яние на состав веществ в прикорневом слое почвы или субстрата,˝ на котором выращивается растение.

8.7.РЕГУЛЯЦИЯ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Âкаждой растительной клетке и во всем организме в целом о˝д-

новременно происходят многие тысячи биохимических реак˝ций,

которые осуществляются строго согласованно в соответст˝вии с ге-

220