Биохимия растений

Чаще всего между субстратом и группировками активного це˝нтра фермента происходят электростатические взаимодейств˝ия за счет образования водородных связей и участия ван-дер-ваал˝ьсовых сил, поэтому образование фермент-субстратного комплекса˝ пред-

ставляет собой легкообратимый процесс, что способствует˝ быстрому прохождению ферментативного превращения. Однако в ряд˝е

ферментативных реакций группировки активного центра об˝разуют ковалентные связи с молекулами субстратов, переводя их в ˝более

реакционно-способное состояние. Так, например, действуют ˝фер-

менты, катализирующие реакции нуклеофильного замещения˝, в

ходе которых осуществляется перенос метильных, ацильных˝ и фос-

фатных групп, остатков моносахаридов, аминокислот, нуклео˝тидов.

Âнекоторых реакциях ведущим фактором перевода субстрат˝а в

активированное состояние является дегидратация, т. е. создание в активном центре фермента такой внутренней среды, которая˝ ли-

шает субстрат контакта с молекулами воды, препятствующим˝и прохождению данной ферментативной реакции.

При взаимодействии фермента с субстратом происходят кон˝-

формационные изменения не только молекулы субстрата, но и˝ белка-фермента. Такой тип взаимодействия объясняется гипотезой индуцированного соответствия, согласно которой предполага-

ется, что в ходе образования фермент-субстратного комплек˝са

аминокислотные остатки в активном центре фермента приоб˝ретают такую пространственную ориентацию, которая позволяет˝ фер-

менту наиболее эффективно выполнять каталитическую фун˝к- цию. Очень часто в процессе такого взаимодействия аминоки˝с-

лотные радикалы фермента определенным образом укладыва˝ются вокруг молекулы субстрата, создавая в активном центре спе˝цифи-

ческую внутреннюю среду, способствующую активации субст˝рата

èего превращению в продукты реакции.

Âсостав каталитического центра ферментных белков входя˝т радикалы аминокислот, содержащих реакционно-способные группировки, которые могут быть донорами или акцепторами˝ протонов. С их участием инициируется отщепление и присоед˝и-

нение протонов к молекуле субстрата или происходит перен˝ос

протонов, в результате чего изменяются состояние ионизац˝ии мо-

лекулы субстрата и ее кислотно-основные свойства и таким ˝обра-

зом усиливается реакционная способность субстрата.

Донорами протонов в составе аминокислотных радикалов яв˝-

ляются группировки, у которых атомы водорода соединены с

электроотрицательными атомами (O, N, S), или группировки,

—NH+3, =NH2+, >NÍ+. Акцепторами протонов могут служить сле-

дующие функциональные группы: —СОО–, —NH2, >NH, >N.

181

Носителями указанных реакционно-способных групп в молекуле белка-фермента cлужат радикалы моноаминодикарбонов˝ых и диаминомонокарбоновых кислот, серина, цистеина, тирозина˝, гистидина, триптофана.

Для выяснения строения каталитического центра фермента˝ необходимо установить последовательность соединения амин˝окис-

лотных остатков в его пептидных цепях, степень олигомерно˝сти белковой молекулы и ее пространственную структуру, а такж˝е оп-

ределить аминокислотные радикалы, участвующие в каталит˝ичес-

ком действии фермента. При этом показано, что некоторые ол˝и-

гомерные ферментные белки могут иметь каталитический це˝нтр в

каждой полипептидной субъединице.

В результате проведенных исследований расшифрована стр˝ук-

тура и изучено действие многих ферментов. В качестве прим˝ера

рассмотрим строение активного центра и вероятный механи˝зм

действия фермента триозофосфатизомеразы, выделенного и˝з кле-

ток трипаносом (одна из форм одноклеточных животных). Этот˝ фермент катализирует изомерные превращения фосфодиокси˝аце-

тона и 3-фосфоглицеринового альдегида.

Молекула триозофосфатизомеразы образуется из двух один˝а-

ковых полипептидных субъединиц, включающих по 250 амино-

кислотных остатков. Каждый такой полипептид имеет на пове˝рхности третичной структуры восемь α-спиралей, а во внутреннем

пространстве систему из восьми β-структур, образующих внут-

реннюю полость (см. рис. 5.6). Активными группировками ката-

литического центра данного фермента являются радикал ли˝зина,

занимающий 13-е положение в аминокиислотной последовательности ферментного белка (считая от N-конца), остаток ги˝с- тидина, находящийся в 95-м положении, и остаток глутаминовой˝

кислоты в 167-м положении. Однако в каталитическом действии также участвуют другие аминокислотные остатки, образующ˝ие внутреннее пространство молекулы фермента. Хотя активны˝й центр формируется в структуре каждого полипептида, не ассоци-

ированные в молекулу полипептидные субъединицы триозоф˝ос-

фатизомеразы не обладают каталитической активностью. Он˝и способны катализировать биохимическое превращение толь˝ко в том случае, когда соединяются в димеры, образующие молеку˝лы фермента.

Рассмотрим механизм ферментативного превращения фосфо-˝

диоксиацетона в 3-фосфоглицериновый альдегид:

Ò

182

В процессе образования фермент-субстратного комплекса ф˝осфатная группа фосфодиоксиацетона образует водородные с˝вязи с электроотрицательными группировками активного центра ф˝ермента

и электростатически взаимодействует с положительно зар˝яженной

+

аминогруппой аминокислотного остатка Lys13(R —CH2 NH3), ïðè

этом в молекуле фермента происходит изменение пространс˝твен-

ной структуры участка полипептидной цепи, включающего ам˝и-

нокислотные остатки в 167 → 178-м положениях. Такое изменение

конформации активного центра приводит к замыканию внутр˝енней полости в третичной структуре полипептида и защищает˝ суб-

страт от воздействия на него молекул воды и других вещест˝в из

внешнего раствора.

183

После образования фермент-субстратного комплекса молек˝ула

фосфодиоксиацетона в активном центре фермента оказывае˝тся в

непосредственной близости от отрицательно заряженной к˝арбоксильной группы аминокислотного остатка глутаминовой ки˝слоты

Glu167, вследствие чего между ними происходит взаимодействие. В˝ результате такого взаимодействия от первого углеродног˝о атома фосфодиоксиацетона отщепляется протон и присоединяется˝ к карбоксильной группе Glu167, а между первым и вторым углеродными атомами субстрата замыкается двойная связь. При этом од-

новременно происходят разрыв двойной связи в кетонной гр˝уппировке и электростатическая стабилизация отрицательного˝ заряда кислорода положительным зарядом аминной группировки ос˝татка лизина Lys13. В стабилизации молекулы субстрата важную роль играет также атом азота гетероциклического радикала гисти˝дина His95, образующего водородную связь с гидроксильной группой субстрата.

В ходе указанной перегруппировки образуется неустойчив˝ое промежуточное соединение, у которого углеродные атомы с д˝вой-

ной связью соединены с гидроксильными группами. Оно спосо˝б- но самопроизвольно превращаться в более устойчивую альд˝егидную форму, а двойная связь между первым и вторым углеродны˝ми атомами подвергается разрыву, инициируя перенос протоно˝в к возникающим свободным связям. В ходе такой перегруппиров˝ки ко второму углеродному атому субстрата переходит протон˝ от

карбоксильной группы глутаминовой кислоты, а к соединенн˝ому с ним атому кислорода с участием гистидинового радикала ф˝ермента осуществляется перенос протона от гидроксильной г˝руппы

первого углеродного атома. Таким образом, молекула фосфод˝иок-

сиацетона превращается в 3-фосфоглицериновый альдегид, ко˝то-

рый и является продуктом рассматриваемого биохимическо˝го превращения. Этот же фермент может катализировать обратн˝ую реакцию изомеризации 3-фосфоглицеринового альдегида в фо˝с- фодиоксиацетон.

Направленность реакции изомеризации, катализируемой тр˝иозофосфатизомеразой, определяется тем, какой из биохимиче˝ских

продуктов (кетонная или альдегидная форма) используется˝ для дальнейших превращений, вследствие чего происходит соот˝вет-

ствующий сдвиг химического равновесия.

У многих ферментов в составе каталитического центра имею˝тся не только реакционно-способные радикалы аминокислотных˝ остатков, но и дополнительные активные группировки неамино˝кислотной природы, присутствие которых строго необходимо дл˝я выполнения ферментом его каталитической функции. В соответ˝-

184

ствии с наличием или отсутствием в активном центре фермен˝та

дополнительной активной группировки неаминокислотной п˝ри-

роды молекулы фермента называют однокомпонентными èëè двухкомпонентными. У однокомпонентных ферментов каталитический

центр образуется только из аминокислотных остатков белк˝а и не содержит каких-либо других небелковых компонентов. У двух˝- компонентных ферментов в структуре активного центра име˝ется

небелковая группировка, которая или непосредственно вза˝имодействует с субстратом, или воздействует на структуру кат˝алити- ческого центра, переводя его в активное состояние.

8.2. СТРОЕНИЕ ДВУХКОМПОНЕНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ

Основой двухкомпонентного фермента, как и однокомпонент˝- ного, является молекула белка, которую в данном случае наз˝ывают апоферментом, а небелковую часть фермента принято называть коферментом. Коферменты образуются из витаминов, нуклеотидов и других активных группировок, включающих атомы метал˝- лов, серы, а также различные органические соединения (гете˝роциклические радикалы пиррола и имидазола, хиноны, липоева˝я

кислота, кетокислоты и др.).

Известны многие ферменты, у которых атомы металлов соеди-˝ нены непосредственно с аминокислотными остатками, форми˝рующими каталитический центр.

Коферменты имеют разные формы соединения с белковой ча- стью фермента. Одни из них довольно легко отделяются от фе˝р- мента и могут самостоятельно участвовать в биохимически˝х реакциях, другие связаны с ферментным белком очень прочно и˝ не могут быть выделены без разрушения молекулы фермента. Ко-˝ ферменты, прочно связанные с ферментным белком, часто наз˝ы-

âàþò простетическими группами. К наиболее хорошо изученным

простетическим группам относятся биотин, липоевая кисло˝та, флавиновые коферменты и железосодержащие коферменты — гемы.

Витамин биотин выполняет роль простетической группы в составе ферментов карбоксилаз, катализирующих реакции обр˝азования карбоксильных групп с участием СО2 (ÍÑΖ3), и карбоксилтрансфераз, участвующих в переносе карбоксильных групп. В˝ составе этих ферментов молекула биотина своей карбоксильн˝ой группой соединяется с ε-аминогруппой остатка аминокислоты лизина, находящегося в структуре белковой части фермента.

185

В ходе реакций карбоксилирования и транскарбоксилирова˝ния

биотин, связанный с белком фермента, вначале превращается˝ в

карбоксибиотин, а затем передает карбоксильную группу на˝ субстрат. При этом установлено, что образование карбоксильно˝й

группы с участием СО2 (ÍÑΖ3) сопряжено с гидролизом АТФ и

эту реакцию также катализирует биотинзависимый фермент˝. В ка-

честве примера рассмотрим действие фермента пируваткар˝бокси-

лазы, катализирующего превращение пировиноградной кисл˝оты в щавелевоуксусную:

Пируваткарбоксилаза имеет крупные молекулы (с молекуляр˝- ной массой до 400 тыс.), проявляющие каталитическую актив-

186

ность при образовании высокомолекулярных комплексов, мо˝лекулярная масса которых может достигать 4—8 · 106. В составе фермента содержатся белковые субъединицы, участвующие в свя˝зывании бикарбонат-иона, АТФ и пирувата, а также катализирующи˝е присоединение карбоксильной группы от бикарбоната к био˝тину с образованием карбоксибиотина и далее перенос карбокси˝льной группы от карбоксибиотина на молекулу пировиноградной к˝исло-

ты, а биотиновый кофермент регенерируется снова в биотин.˝ Липоевая кислота в качестве простетической группы входит в

состав ферментов, катализирующих окислительное декарбо˝ксили-

рование α-кетокислот. Как и биотин, она соединяется амидной связью с ε-аминогруппой аминокислоты лизина, входящего в состав

В процессе реакции липоевая кислота подвергается восста˝нов-

лению и становится акцептором ацильного радикала кетоки˝слоты, после чего ацильный радикал связывается с другим кофе˝рмен-

том, а липоевая кислота снова превращается в окисленную (ц˝ик-

лическую) форму:

Как установлено, ферменты, катализирующие реакции окисли˝- тельного декарбоксилирования α-кетокислот, образуют сложные

комплексы, включающие разные типы коферментов, состоящие˝

из многих субъединиц и имеющие большую молекулярную масс˝у

187

(1 – 9 · 106). Наиболее хорошо изучены структура и механизм действия ферментных комплексов, катализирующих окислитель˝ное декарбоксилирование пировиноградной и α-кетоглутаровой кислот (см. с. 332—333, 335).

Флавиновые простетические группы представлены двумя вида-

ми соединений — флавинадениндинуклеотидом (ФАД) и флави˝н- мононуклеотидом (ФМН), которые ковалентно связаны с ферментными белками.

Коферментная группировка ФМН представляет собой витамин рибофлавин, фосфорилированный по спиртовой группе пя˝- того углеродного атома рибита, а в составе ФАД к ФМН путем взаимодействия фосфатных остатков присоединяется нукле˝отидный радикал аденозинмонофосфата (АМФ). Чаще всего флавиновая простетическая группа соединяется с ферментным белк˝ом путем образования ковалентной связи между углеродом метил˝ьной группы, соединенной с восьмым углеродным атомом диметилизоаллоксазина, и азотом гетероциклического радикала ги˝стидина

или атомом серы цистеинового остатка в составе белка.

188

Каталитическая активность указанных простетических гру˝пп проявляется в том, что они способны присоединять атомы во˝дорода к атомам азота диметилизоаллоксазина в положениях 1 ˝и 5 с последующей перегруппировкой двойных связей:

Âрезультате присоединения атомов водорода флавиновый к˝о-

фермент превращается в восстановленную форму, которая со˝кра-

щенно записывается ФАД · Н2 èëè ÔÌÍ · Í2, а окисленная форма

соответственно ФАД и ФМН.

При этом считается, что один атом водорода отщепляется от˝

субстрата в виде протона (Н+), а другой — в виде гидрид-иона (Н–).

Âпроцессе взаимодействия с флавиновым коферментом прот˝он

присоединяется к атому азота диметилизоаллоксазина в по˝ложе-

нии 1, а гидрид-ион — к атому азота в положении 5. В виде таких˝ же ионных форм происходит отщепление водорода и от восста˝-

новленного флавинового кофермента.

Âнастоящее время известны несколько десятков ферментов, имеющих флавиновые коферменты. Они могут функционироват˝ь в качестве переносчиков водорода в дыхательных реакциях˝ и катализируют многие реакции окисления: спиртов в альдегиды, д˝и-

гидролипоевой кислоты в липоевую, гликолевой кислоты в гл˝ио-

ксиловую. С участием флавиновых ферментов происходят обр˝азование α,β-ненасыщенных производных жирных кислот и превращение янтарной кислоты в фумаровую.

У некоторых флавиновых ферментов в активном центре наряд˝у

с флавиновым коферментом имеются атомы металлов. Так, на-

пример, ксантиноксидаза некоторых микроорганизмов, явля˝ющаяся димерным белком, содержит в каждой субъединице флавин˝о- вый кофермент в виде ФАД, один атом Мо и четыре атома Fe.

Важные функции в организмах выполняют ферменты, имею-

щие в своем составе простетические группы в виде гема. Ãåìû

представляют собой устойчивые хелатные комплексы порфи˝рино-

вой группировки с атомом железа. Порфириновая группировк˝а

189

образуется из четырех гетероциклических структур пирро˝ла (обозначаемых À, Â, Ñ, D), соединенных метеновыми радикалами (=СН—) в более крупную циклическую группировку, к которой присоединены еще восемь боковых радикалов. В зависимости˝ от

строения этих радикалов различают разные типы гемов (про˝тогем, гем à, ãåì c è äð.).

190