Биохимия растений

При соединении со специфическим белком гем может выполнять роль переносчика электронов или кислорода, катализи˝ровать окислительно-восстановительные реакции с участием кисл˝орода или пероксида водорода.

Гемопротеиды, участвующие в переносе электронов, получил˝и название цитохромов. Все они представляют собой сравнительно

низкомолекулярные белки, имеющие в качестве простетичес˝кой группы гем, прочно связанный с молекулой белка. Цитохромы˝,

различающиеся строением гема и белковой молекулы, обычно˝

обозначают латинскими буквами à, â, ñ, d, f.

Выяснено, что в цитохромах à è à3 простетической группой

служит гем à, а в цитохромах â4, ñ è f — протогем, соединенный двумя винильными группами (—СН=СН2) с НS-группами цистеи-

на в составе молекулы белка, образуя ковалентные связи с б˝елком:

Rã —CH=CH2 + HS—Rá → Rã—CH—CH3,

S—Rá

ãäå Rã — радикал гема; Rá — радикал белка.

Активным компонентом в структуре гема, принимающим

участие в переносе электронов, является атом железа. В оки˝сленном цитохроме железо содержится в виде Fe3+, а после присо-

единения электрона оно превращается в восстановленную форму

Fe2+ :öèò(Fe3+)+e → öèò(Fe2+).

Восстановленный цитохром передает электрон другому акц˝еп-

тору, превращаясь в окисленную форму, способную снова при˝сое-

динять электрон от донора:

Öèò (Fe2+) + Акцептор → Öèò (Fe3+) + Восстановленный

акцептор

Наиболее хорошо изучено строение цитохрома c, который представляет собой водорастворимый белок, включающий 104 аминокислотных остатка. Как показали структурные исслед˝ова-

ния, при формировании третичной структуры цитохрома c ïåï-

тидная цепь белка укладывается вокруг гема и образует сво˝еобразную оболочку, которая защищает его от воздействия внеш˝него раствора. В структуре фермента атом железа образует коорд˝инаци-

онные связи с азотом гетероциклического радикала гистид˝ина,

находящегося в положении 18 первичной структуры белка, и ат˝о-

мом серы метионина в положении 80.

Ферменты пероксидаза и каталаза содержат простетическу˝ю группу в виде протогема, включающего железо в виде Fe3+. Ïå-

191

роксидазы катализируют окислительно-восстановительные˝ реакции с участием пероксида водорода (Н2Î2) по схеме

H2O2 + AH2 ¾¾¾¾¾¾®Пероксидаза 2Í2O + A

Много этих ферментов синтезируется в растительных тканя˝х,

особенно в пероксисомах.

Каталаза катализирует разложение пероксида водорода на˝ воду

и кислород:

2H2O2 ¾¾¾¾Каталаза¾® 2Í2Î+ Î2

Пероксид водорода оказывает повреждающее воздействие н˝а клеточные мембраны, подвергая их пероксидному окислению˝, а

фермент каталаза предотвращает накопление Н2Î2 в клетках орга-

низма.

Протогем входит также в состав белков гемоглобина, миогло˝-

бина, легоглобина, осуществляющих перенос кислорода. Они ˝со-

держат железо в восстановленной форме (Fe2+). У этих белков в связывании кислорода участвует не только восстановленн˝ая фор-

ма железа (Fe2+), но и имидазольная группа гистидина, находяще-

гося в структуре полипептидной цепи. При удалении такой г˝руппы из структуры белка протогем не способен связывать атом˝ы

кислорода.

Активную роль в переносе электронов играют железосерные˝ белки, у которых простетическая группа образуется атомами же-

леза, соединенными с лабильными атомами серы. Атомы Fe простетической группы соединяются с белком через атомы серы˝ че- тырех остатков цистеина. Очень часто атомы железа при сое˝динении с атомами серы образуют Fe4S4-кластеры. Строение одного из них показано на рисунке 8.3. Полипептидная цепь этого белка закручена вокруг железосерной простетической гру˝ппы, включающей по четыре атома железа и серы, а также боковые

Рис. 8.3. Пространственное изображение Fe4S4-кластера в составе железосерного белка:

Fe — атомы железа; S — атомы лабильной серы; Á — полипептидные цепи белка, соединенные с атомами Fe через тиоловые группировки цистеиновых остатков

192

цепи четырех остатков цистеина, связанных через атомы серы с железом. Каждый из атомов серы в Fe4S4-кластере связан с тремя атомами железа.

Простетическая группа железосерного белка способна при˝сое-

динять и передавать другому акцептору один электрон. При ˝этом электроны, акцептируемые Fe4S4-кластером, не присоединяются

к какому-либо конкретному атому, а взаимодействуют с атом˝ами

èFe, è S.

Êжелезосерным белкам относятся также ферредоксины бак-

терий и растений, осуществляющие одноэлектронный перено˝с.

Их простетические группы могут содержать по два или четыр˝е

атома железа и такое же число атомов серы. Так, например, в ферредоксине растительных хлоропластов содержится желе˝зо-

серный кластер, включающий два атома железа и два атома ла˝-

бильной серы. С белковой частью атомы железа соединены че˝рез

атомы серы цистеиновых остатков. Строение простетическо˝й

группы хлоропластного ферредоксина можно представить в˝ виде следующей схемы:

Êчислу коферментов, которые связаны с белковой частью фе˝р-

мента лабильными связями, относятся никотинамидаденинд˝инуклеотид (НАД), никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ),˝

кофермент А (КоА), а также коферментные формы витаминов В1,

Â6, Â12, фолиевой кислоты. Эти коферменты удерживаются в ак-

тивном центре ферментов водородными связями и силами эле˝ктростатического взаимодействия заряженных группировок к˝офермента и функциональных групп аминокислотных остатков, об˝разующих активный центр фермента. В связи с этим указанные коферменты легко отделяются от белковой части фермента.

Молекулы кофермента НАД образуются из витамина РР (амид никотиновой кислоты) и нуклеотида АМФ (аденозинмонофосфат), соединенных через остатки ортофосфорной кислоты, и п˝о химическому строению представляют собой динуклеотиды.

НАДФ отличается от НАД только наличием дополнительной фо˝с- фатной группировки, присоединенной ко второму атому угле˝рода

рибозы в составе АМФ.

Ферменты, имеющие в своем составе НАД и НАДФ, катализируют реакции отщепления водорода от восстановленных суб˝стратов и перенос их на соответствующий акцептор. Очень часто˝ таким акцептором служит окисленный флавиновый кофермент.

193

Активной группировкой, участвующей в отщеплении и переносе водорода, служит окисленная форма никотинамида. Иссл˝е- дователи считают, что от субстрата отщепляются два атома ˝водорода в виде гидрид-иона (Н–) и протона (Н+), при этом гидридион присоединяется к четвертому углеродному атому никот˝инамида в составе фермента, переводя его в восстановленную ˝форму,

а протон не связывается с коферментом и в дальнейшем непо˝сред-

ственно переходит на акцептор, с которым взаимодействует˝ вос-

становленный кофермент, передавая на акцептор два электр˝она и

протон в виде гидрид-иона (Н–).

Окисленную форму НАД принято сокращенно записывать в

âèäå ÍÀÄ+, а восстановленную — НАД · Н. Соответственно окис-

ленная форма НАДФ записывается НАДФ+, восстановленная — НАДФ · Н. Поскольку в реакциях, катализируемых НАД- и НАДФ-содержащими ферментами, происходит отщепление водо˝-

194

рода от субстратов, такие ферменты называют дегидрогеназами. Схематически действие дегидрогеназы, имеющей кофермент˝

НАД, можно представить следующим образом:

Субстрат—Н2 + ÍÀÄ+—Фермент →

→ Субстратîê + Фермент—НАД · Н + Н+

Фермент—НАД · Н + Н+ + Акцептор → → ÍÀÄ+—Фермент + Акцептор—Н2

НАД и НАДФ очень легко отделяются от ферментного белка и могут существовать в свободной форме, диффундируя от одно˝го фермента к другому. Свободные формы этих коферментов могу˝т также переноситься по флоэмной системе растений от донор˝ных клеток и органов к акцепторным.

НАД-зависимые ферменты наиболее активны в ускорении реакций, связанных с отщеплением водорода от субстратов, а ф˝ерменты, имеющие восстановленные коферменты НАДФ, чаще все-˝

го используются как сильные восстановители.

Ферменты, катализирующие перенос ацильных групп

имеют в каталитическом центре активную группировку, назы˝ваемую коферментом А (КоА), которая связана с апоферментом ла-

бильными (нековалентными) связями и поэтому может легко о˝т-

деляться от фермента.

195

Âсоставе КоА содержится остаток β-меркаптоэтиламина с ре- акционно-способной HS-группой, соединенной амидной связью˝

ñкарбоксильной группой пантотеновой кислоты, которая фо˝сфорилирована по концевой гидроксильной группе. Через остат˝ок ор-

тофосфорной кислоты указанная группировка соединяется ˝с нуклеотидной частью, представленной аденозинмонофосфатом

(АМФ), у которого гидроксил при третьем углеродном атоме р˝и- бозы этирифицирован дополнительным фосфатным остатком.˝

Соединение кофермента А с белковой молекулой происходит˝

путем образования водородных связей и возникающих элект˝ро-

статических взаимодействий между аминокислотными радик˝ала-

ми белка в активном центре фермента и группировками нукле˝о- тидной части и пантотеновой кислоты кофермента.

Âходе ферментативной реакции кофермент А взаимодейству˝ет

ñсубстратом за счет HS-группы β-меркаптоэтиламина, находя-

щейся на конце довольно длинной гибкой цепи, которая хорошо

приспособлена к созданию структурного соответствия меж˝ду активным центром фермента и субстратом. В уравнениях реакци˝й

принято использовать сокращенное обозначение кофермент˝а

А—HS—КоА. Образование ацильных производных кофермента А

сопряжено с гидролизом АТФ:

При этом между углеродом карбонильной группы карбоновой˝

кислоты и атомом серы кофермента возникает макроэргичес˝кая тиоэфирная связь. Активированный таким образом ацильный˝ ра-

дикал может далее переноситься к центрам синтеза или β-окисле-

ния жирных кислот, где он уже соединяется с новым апоферме˝н-

том и подвергается дальнейшим превращениям.

В форме ацетилкофермента А этот кофермент

включается в реакции цикла ди- и трикарбоновых кислот, а та˝кже глиоксилатного цикла и участвует в целом ряде других прев˝ращений.

Коферментной формой витамина В1 является фосфорилиро-

ванное производное тиамина — тиаминпирофосфат, которое пи-

римидиновым кольцом соединяется с белковой частью фермента, а тиазоловой группировкой взаимодействует с субстратами — α-кетокислотами или α-кетоспиртами. Для проявления каталити- ческой активности ферментов, имеющих в качестве кофермен˝та тиаминпирофосфат, необходимы также катионы двухвалентн˝ых

металлов Mg2+ èëè Mn2+, которые соединяются с пирофосфатной

группой. В ходе ферментативной реакции осуществляется α-ðàñ-

щепление указанных субстратов, в результате чего происхо˝дит де-

196

карбоксилирование α-кетокислот или альдольное расщепление α-кетоспиртов.

У растений хорошо изучены реакции декарбоксилирования α-кетокислот, играющие важную роль в процессе дыхания. На пер-

вом этапе реакции α-расщепления вследствие диссоциации происходит процесс отщепления протона от атома углерода, сое˝ди-

ненного с азотом и серой в кольце тиазола, в результате чег˝о образуется биполярный ион тиазолия, который при взаимодейств˝ии с

α-кетокислотой дает промежуточный продукт, способный легк˝о

распадаться на ион тиазолия, альдегид и СО2:

197

В составе многих ферментов, катализирующих превращения аминокислот и аминов, в качестве кофермента используется˝ про-

изводное витамина В6 пиридоксальфосфат (ПДФ). Этот кофермент

может оказывать каталитическое действие как в составе фе˝рмента, так и в свободном виде. Однако под воздействием белка, обра˝зующего фермент, значительно возрастает скорость реакции и с˝пеци-

фичность действия катализатора.

Активной частью кофермента является альдегидная группа˝,

которая обратимо реагирует с аминокислотами, при этом в к˝аче-

стве промежуточного продукта образуется шиффово основание. Каталитическое действие кофермента усиливается наличие˝м в

пиридиновом кольце НО-группы, способной диссоциировать с˝

образованием протона (Н+), который, присоединяясь к атому азота, образует биполярный ион пиридоксальфосфата. Фосфат-

ный радикал —СН2О Р участвует в образовании лабильных связей

с молекулой ферментного белка.

Образовавшееся из аминокислоты и кофермента шиффово ос-

нование затем подвергается превращениям в результате ра˝зрыва

связей, соединяющих α-углеродный атом аминокислоты с водородом, карбоксильной группой или радикалом R, при этом образу˝-

ются хиноидные соединения, при распаде которых аминокисл˝ота

превращается в кетокислоту или в ее молекуле происходят з˝амещения у β- è γ-углеродных атомов. При декарбоксилировании

шиффова основания аминокислота превращается в амин. В ход˝е

распада промежуточных хиноидных соединений также высво˝бождается кофермент в виде пиридоксальфосфата или пиридокс˝амин-

фосфата (ПАФ), который с помощью вспомогательной реакции регенерируется в пиродоксальфосфат.

Рассмотрим превращение шиффовых оснований в ходе реакций переаминирования, в результате которых осуществляет˝ся пе-

ренос аминогруппы от аминокислоты на α-кетокислоту.

198

(штриховой линией показано место разрыва связей)

Âходе такой реакции аминокислота с радикалом R, соединяяс˝ь

âактивном центре фермента с пиридоксальфосфатом, образует

шиффово основание 1, в котором под влиянием фермента проис˝- ходит отщепление протона от α-углеродного атома аминокислоты и присоединение его к углероду альдегидной группы коферм˝ента,

âрезультате чего образуется шиффово основание 2. В дальне˝йшем

шиффово основание 2 подвергается гидролизу по двойной свя˝зи,

соединяющей α-углеродный атом аминокислоты с азотом. В ре-

зультате гидролиза шиффово основание 2 превращается в два˝ продукта — α-кетокислоту и пиридоксаминфосфат.

Превращение ПАФ в ПДФ происходит в результате обратной реакции, когда ПАФ, реагируя уже с другой кетокислотой, пос˝ледовательно проходит все стадии обратных реакций и превра˝щается в шиффово основание 1, при гидролизе которого образуютс˝я новая аминокислота и регенерированный пиридоксальфосфа˝т.

199

Следует отметить, что молекулы двухкомпонентных фермент˝ов проявляют каталитические свойства только при соединени˝и с бел-

ком соответствующего кофермента или простетической гру˝ппы, которые определяют направление ферментативного превращ˝ения субстрата. Однако специфичность действия фермента завис˝ит так-

же от природы ферментного белка, с которым соединяется ко˝фер-

ìåíò.

8.3. КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ

Ферменты обнаруживают в клетках и тканях организмов по их˝

способности катализировать биохимические реакции, кото˝рая вы-

ражается специальным показателем, называемым активностью фермента. Этот показатель можно определить по количеству˝ про-

реагировавшего субстрата или накоплению продуктов реак˝ции

в единицу времени. При этом создаются оптимальные условия˝ для действия фермента (оптимальные температура, рН и ионный с˝о- став среды). На основе указанных измерений оценивается ск˝о- рость ферментативного превращения субстрата, которая в каждый

200