Биохимия растений

Рис. 8.4. Кинетическая кривая ферментативной реакции:

1 — касательная к кинетической кривой в нулевой момент времени; 2 — касательная к кинетической кривой в точке, соответствующей промежутку времени t

отдельный момент определяется наклоном касательной к ки˝нети-

ческой кривой (рис. 8.4).

Кинетическая кривая — это графическое выражение изменения

концентрации субстрата или продукта реакции в зависимос˝ти от

времени реакции. Чем больше наклон касательной к кинетиче˝с-

кой кривой, тем выше скорость реакции. Самая высокая скоро˝сть

превращения достигается в начальный момент времени, а зат˝ем скорость реакции уменьшается вследствие понижения конц˝ентра-

ции субстрата и одновременного накопления образующихся˝ про-

дуктов, увеличивающих скорость обратной реакции.

Исходя из указанных особенностей прохождения ферментат˝ив-

ной реакции, активность ферментов рекомендуется определ˝ять по начальной скорости реакции и за возможно короткий промеж˝уток

времени, чтобы получить практически линейную кинетическ˝ую

кривую.

По рекомендации Международного биохимического союза за˝

единицу каталитической активности фермента принят катал

(êàò). Один катал — это каталитическая активность, способная˝ катализировать превращение 1 моля субстрата за 1 с при опт˝и- мальных условиях и в заданной системе определения активн˝ости.

Очень часто для выражения активности ферментов использу˝ют так-

же производные от катала единицы: микрокатал (мккат) = 10–6 кат, нанокатал (нкат) = 10–9 кат, пикокатал (пкат) = 10–12 êàò.

В каталах и производных от него единицах измеряют общую активность фермента, которая зависит как от каталитическ˝их

свойств ферментного белка, так и количества фермента, уча˝ствую-

щего в реакции.

Для характеристики каталитической активности чистых фе˝р- ментных препаратов используют показатель удельная активность,

который выражается в каталах в расчете на 1 кг ферментного˝ пре-

парата (кат · кг–1) или в других производных от катала и килограм-

ма единицах. При определении удельной активности в тканях˝ жи-

вого организма данный показатель выражает содержание фе˝рмента в биологическом источнике.

201

Каталитическую активность фермента наиболее точно можн˝о выразить с помощью показателя, называемого молярной активностью, которая измеряется в каталах в расчете на 1 моль фермента (кат · мольô–1). Она показывает, какое число молекул субстрата

превращается за 1 с одной молекулой фермента. В отдельных˝ слу- чаях расчет активности фермента проводится с учетом числ˝а ак-

тивных центров в его молекуле и такой показатель называют˝числом оборотов èëè молекулярной активностью, он выражается в ка-

талах в расчете на 1 моль активных центров фермента.

Для многих ферментов показатель молярной активности име˝ет

очень высокие значения (до 106), поэтому скорости реакций, ката-

лизируемых ферментами, в десятки и даже сотни тысяч раз пр˝евышают скорости реакций, происходящих без участия ферменто˝в.

Вследствие того что в активном центре происходит активир˝ование

и сближение молекул реагирующих субстратов, ферментатив˝ные

реакции протекают с высокой скоростью даже при низкой кон˝-

центрации реагирующих веществ в физиологической среде. Так, например, фермент каталаза, участвующий в разложении˝ пе-

роксида водорода на воду и кислород, способен катализиров˝ать

превращение 2 · 105 молекул субстрата за 1 с в расчете на активный

центр фермента.

Âсвязи с тем что активный центр фермента должен структур˝но соответствовать субстрату, изменение его конформации мо˝жет

снижать каталитические свойства ферментной молекулы. По˝это-

му любые воздействия на фермент, вызывающие изменение

структуры активного центра, влияют на каталитическую спо˝соб-

ность фермента, тогда как изменение конформации молекулы˝, не затрагивающее активный центр, меньше влияет на каталитич˝еские свойства фермента.

Âфизиологической среде, в которой находятся молекулы ферментов, могут присутствовать химические компоненты, вызывающие инактивацию или даже разрушение молекул фермен˝- та. Поэтому каждый фермент может активно функционировать˝

лишь определенное время, после чего его молекулы становят˝ся

неактивными. Продолжительность жизни фермента определя˝ется его ролью в обмене веществ и генотипом организма. Для ха˝- рактеристики продолжительности жизни ферментов использ˝уют показатель — период полужизни ферментов, который для расти-

тельных объектов варьирует от нескольких часов до нескол˝ьких

суток.

Âсвязи с инактивацией и распадом ферментов в клетках жив˝о- го организма постоянно происходит процесс синтеза новых˝ моле-

кул ферментов. Такая особенность ферментов имеет важное био-

логическое значение для регуляции их синтеза и хода ферме˝нта-

тивных превращений. Если бы ферменты не инактивировались˝, то

202

однажды синтезированный фермент длительное время не пре˝кращал бы своей деятельности и реакцию, катализируемую этим ˝ферментом, было бы трудно регулировать в соответствии с потр˝ебностями организма.

8.4. ИЗОФЕРМЕНТЫ

Большинство ферментов представлены в клетках организма˝ в

виде множественных молекулярных форм, называемых изофер˝- ментами или изоэнзимами. Изоферменты — это сходные по струк-

туре белковые молекулы, способные катализировать одну и т˝у же

биохимическую реакцию, но различающиеся по первичной стр˝ук-

туре входящих в их состав полипептидов. Они имеют одинако˝вую

структуру каталитического центра, вследствие чего облад˝ают одним типом субстратной специфичности. Изоферменты одного˝ и

того же фермента отличаются оптимумами рН, температуры, д˝ру-

гих условий внешней среды, их молярной активностью, но все˝

они катализируют одну и ту же реакцию. Когда из клеток орга˝низ-

ма выделяют какой-либо фермент и определяют его активност˝ь, всегда имеют дело с его конкретными изоферментами.

Молекулы ферментов чаще всего представляют собой олигом˝е-

ры, построенные из двух или нескольких полипептидов, кото˝рые

в той или иной степени различаются первичными структурам˝и, но

имеют однотипную третичную структуру и поэтому при взаим˝о- действии образуют функционально родственные белки. Как б˝ыло

показано ранее, различающиеся первичными структурами по˝ли-

пептиды в составе олигомерных молекул кодируются разным˝и ге-

нами, поэтому природа и набор изоферментов определяются г˝е- нотипом организма.

Впервые механизм образования изоферментов был выяснен при изучении множественных молекулярных форм фермента л˝ак-

татдегидрогеназы, катализирующего в клетках человека и ж˝ивот-

ных превращение молочной кислоты в пировиноградную:

В ходе исследований были выделены кристаллические препа˝- раты лактатдегидрогеназы из клеток печени, сердечной мыш˝цы и

скелетных мышц и подвергнуты разделению методом электро˝фореза в щелочной буферной системе (рН 8,8). В таких условиях мо˝-

лекулы фермента имеют отрицательный заряд и в зависимост˝и от величины заряда проявляют разную подвижность по направл˝ению

к аноду. В процессе электрофоретического разделения было˝ выде-

лено пять белковых фракций, каждая из которых представлял˝а со-

203

бой тетрамерные молекулы с молекулярной массой около 140 тыс., образованные из различных комбинаций двух типов полипептидов, обозначаемых Í è Ì. Полипептиды Í наиболее активно синтезируются в сердечной мышце и печени и содержат˝ в

своем составе больше остатков моноаминодикарбоновых ки˝слот. Полипептиды второго типа (Ì) синтезируются преимущественно

в скелетных мышцах и характеризуются меньшим содержание˝м дикарбоновых аминокислот. С участием указанных типов пол˝и-

пептидов образуется пять разновидностей ферментных мол˝екул,

являющихся изоферментами лактатдегидрогеназы: Í4, Í3Ì, Í2Ì2,

ÍÌ3, Ì4. Каждая молекула изофермента, как тетрамер, состоит из

четырех полипептидов, которые могут быть идентичными (Í4 è Ì4) или разными (Í3Ì, Í2Ì2, ÍÌ3). Количественное содержание

каждого изофермента в данной ткани зависит от концентрац˝ии в

ней полипептидов Í è Ì.

Вследствие того что полипептиды Í содержат в своем составе

больше остатков дикарбоновых аминокислот, тетрамер Í4 при рН 8,8 среды имеет наибольший отрицательный заряд, поэтому

быстрее движется к аноду в процессе электрофореза (рис. 8.5).

Тетрамер Ì4 характеризуется наименьшей подвижностью к

аноду, так как его молекулы построены из полипептидов с ме˝нь-

шим содержанием дикарбоновых аминокислот. Другие изофер˝- менты распределяются при электрофорезе между фракциями˝Í4 è

Ì4 в зависимости от числа полипептидов Í è Ì в их молекулах.

Из примера с лактатдегидрогеназой следует, что если молек˝ула

фермента — тетрамер, образованный из двух типов полипеп˝тидов,

то возникают пять изоферментов. Но если молекулы тетрамер˝ного фермента формируются из трех типов полипептидов, наприме˝рÀ, Á è Â, то возникают следующие комбинации полипептидов в мо-

204

Таким образом, общий набор изоферментов данного ферментного белка определяется степенью олигомерности его моле˝кулы и числом разных полипептидов, из которых образуются молеку˝лы белка. Следует отметить, что к изоферментам не относятся м˝оле-

кулы фермента, измененные в результате повреждения струк˝туры белка или модификации его молекул путем присоединения ак˝тив-

ных группировок (так называемая посттрансляционная моди˝фикация белков).

Поскольку изоферменты — это определенный набор белковы˝х

молекул, способных катализировать превращение одного и т˝ого

же субстрата, для их выявления используют методы разделен˝ия,

принятые для белков, с последующим определением каталити˝ческой активности. Наиболее часто для разделения изофермент˝ов ис-

пользуют метод электрофореза в полиакриламидном геле, ко˝то-

рый по сравнению с другими методами имеет наиболее высоку˝ю

разрешающую способность. При разделении этим методом мож˝но

выявить изоферменты, различающиеся по суммарному заряду˝ молекулы, который определяется содержанием в белке остатко˝в мо-

ноаминодикарбоновых кислот. Если же в составе организма и˝ме-

ются генетические варианты молекул фермента, у которых ра˝зли-

чия в аминокислотном составе не приводят к изменению заря˝да

молекулы, то для их разделения используют модификации эле˝ктрофореза, основанные на других принципах, например изоэле˝кт-

рофокусирование белков.

Особенно большое разнообразие множественных молекуляр-˝

ных форм наблюдается у растительных ферментов. Практически

каждый фермент представлен в растении в виде набора изофе˝р- ментов, каждый из которых проявляет каталитическую актив˝ность в строго определенных условиях, зависящих от параметров в˝нут-

ренней физиологической среды, что позволяет организму об˝еспе- чивать специфичность обмена веществ в данном органе, ткан˝и или внутриклеточном компартменте (межмембранном отсеке˝). Так, например, в листьях и корнях растений разная физиолог˝ичес-

кая среда, но в них может проходить одна и та же реакция за с˝чет

того, что ее катализируют разные изоферменты данного ферм˝ента. При изучении у растений картофеля изоферментов фосфорил˝азы, катализирующей расщепление крахмала, было выявлено, что в˝се органы картофеля (корни, листья, клубни) имеют специфическ˝ий

набор изоферментов этого фермента, который определяли эл˝ект-

рофорезом в кислой буферной системе (рис. 8.6). При таких усл˝о- виях разделения ферментные белки имеют положительный за˝ряд, обусловленный наличием в белках диаминомонокарбоновых ˝кис-

лот, вследствие чего белки проявляют подвижность к катоду˝.

В процессе роста и развития растений постоянно изменяютс˝я

внутренняя физиологическая среда и внешние условия, в соо˝твет-

205

Рис. 8.6. Электрофореграммы изоферментов фосфорилазы картофеля:

1 — клубни; 2 — листья; 3 — корни

ствии с этим изменяется и набор изоферментов каждого фермента. Наиболее четко проявляют-

ся качественные и количественные изменения

состава изоферментов при созревании и прорастании семян.

На рисунке 8.7 показаны электрофореграм-

мы изоферментов α-амилазы созревающего,

зрелого и прорастающего зерна пшеницы, раз-

личающихся по их подвижности к аноду. При сравнении элект˝рофореграмм видно, что в созревающем зерне пшеницы амилолит˝и-

ческой активностью обладают пять изоферментов с низкой п˝од-

вижностью к аноду, в прорастающем зерне также пять, но уже

других по электрофоретической подвижности изоферментов˝.

Вследствие того что при созревании зерна происходит связ˝ывание амилаз белковыми ингибиторами в неактивный комплекс, в по˝л-

ностью созревшем зерне при благоприятных погодных услов˝иях

выявляется слабая амилолитическая активность только од˝ного

изофермента α-амилазы. Однако в зерновках, сформировавшихся

при влажной погоде, активность большинства изоферментов˝α-ами- лаз, выявленных в созревающем зерне, сохраняется.

Специфичность обмена веществ у больных и здоровых расте-

ний также осуществляется за счет синтеза определенного н˝абора

изоферментов, обеспечивающих ход жизненно важных биохим˝и-

ческих реакций. Как установлено в опытах по изучению особ˝ен-

ностей функционирования ферментных систем при различны˝х заболеваниях большого набора растений, в листьях и других о˝рганах больных растений очень часто возрастает число изоформ ок˝исли- тельно-восстановительных ферментов. Полу-

ченные данные свидетельствуют о том, что при

анализе сведений об изоферментах необходимо учитывать возраст и физиологическое состояние растений, а также обязательно знать, из какого органа, ткани или внутриклеточного ком-

партмента они выделены.

Рис. 8.7. Электрофореграммы изоферментов α-амилазы

пшеницы:

1 — созревающее зерно в фазе молочно-восковой спелости; 2 — зрелое зерно, сформировавшееся при сухой погоде; 3 — зрелое зерно, сформировавшееся при влажной погоде; 4 — зерно трехсуточных проростков. Стрелкой показано направление движения моле˝кул изоферментов при электрофорезе, справа дана шкала относи˝тельной электрофоретической подвижности белковых компонент˝ов

206

Наличие в клетках организма множественных молекулярных˝ форм одного и того же фермента, проявляющих каталитическу˝ю активность при разных физиологических условиях, позволя˝ет организму осуществлять с необходимой интенсивностью би˝охи-

мические процессы при изменении условий внешней среды.

При изменении внешних условий они становятся неблагопри˝-

ятными для проявления каталитической активности опреде˝ленных изоферментов, но биохимическая реакция не прекращает˝ся,

так как вступают в действие другие изоферменты, которые с˝по-

собны катализировать данное превращение в изменившихся˝ усло-

виях. Если появляется новый изофермент, то он расширяет ди˝апа-

зон выживаемости организма. Чем больше набор изоферменто˝в, тем шире диапазон их действия и лабильнее адаптация орган˝изма

к неблагоприятным факторам внешней среды.

Так, у гетерозисных растений выявлены «гибридные» изофер-

менты, которых нет у родительских генотипов, именно с появ˝ле-

нием этих новых изоферментов связывают увеличение мощно˝сти и жизнеспособности гетерозисных растений, что в конечном˝ ито-

ге приводит к повышению их продуктивности.

Изучение ферментных систем растений показывает, что спец˝и-

фичность обмена веществ у разных генотипов обеспечивает˝ся ха-

рактерным для каждого генотипа набором изоферментов. Чем˝ ближе генотипы растений в систематическом отношении, тем˝

меньше различается у них изоферментный состав ферментов˝. В

связи с этим изоферментный анализ довольно успешно приме˝ня-

ется для уточнения систематики живых организмов, выявлен˝ия

филогенетического родства между видами и сортами растен˝ий, а также проверки генетической чистоты или, наоборот, генети˝ческого разнообразия растительной популяции.

8.5.ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

ÂЗАВИСИМОСТИ ОТ УСЛОВИЙ СРЕДЫ

На каталитические свойства ферментных белков влияют мно˝-

гие химические и физические факторы, способные воздейств˝овать

на структуру активного центра, скорость образования и рас˝пада фермент-субстратного комплекса, состояние ионизации мол˝екул субстрата и определенных группировок фермента (температ˝ура, рН и ионный состав среды, присутствие активаторов и ингиб˝иторов, окислительно-восстановительный потенциал среды, кон˝цен-

трация субстрата и фермента, влияние внешнего электричес˝кого

поля и др.). Действие этих факторов оказывается возможным б˝ла-

годаря тому, что ферменты являются белками, которые довол˝ьно

легко перестраивают пространственную структуру молекул˝ы под

207

влиянием условий внешней среды и, следовательно, проявляю˝т высокую лабильность в изменении своих физико-химических˝

свойств. При оценке влияния факторов внешней среды на кат˝али-

тические свойства ферментов следует также учитывать, что˝ в каждом конкретном случае определяется активность того набо˝ра изоферментов, которые определяют специфичность обмена веще˝ств в

исследуемом биологическом объекте.

Влияние температуры. Ферментативные реакции могут происходить в интервале температур от 0 °С (точка замерзания воды) до

70...80 °С (тепловая денатурация белков высших организмов). Пр˝и

повышении температуры увеличиваются скорости химически˝х реакций, в том числе и скорость образования фермент-субстра˝тных

комплексов, поэтому активность ферментов возрастает, вслед-

ствие чего происходит интенсификация процессов жизнеде˝ятельности растений.

Ускорение реакций под воздействием повышенной температ˝у-

ры обусловлено тем, что снижается энергия активации как с˝убстрата, так и фермента. В интервале температур 0...40 °С повыше˝-

ние температуры на 10 °С увеличивает скорость ферментативных

реакций в 1,4...2 раза. Наиболее высокая активность ферментов наблюдается при температурах 40...50 °С. При температурах свы˝ше

50 °С активность ферментов понижается, так как начинается˝ про-

цесс тепловой денатурации ферментных белков, вызывающий˝ необратимое изменение четвертичной, третичной и вторичн˝ой

структур белковых молекул. Полная денатурация растительных

белков в растворе, как указывалось ранее, происходит при т˝емпературах 70...80 °С.

Однако в негидратированном (сухом) состоянии белки спосо˝б- ны сохранять нативные свойства и при более высокой темпер˝атуре, что используется в технологиях быстрого высушивания з˝ерна и семян без снижения их всхожести. Не происходит необратимо˝й инактивации ферментов также и при замораживании растите˝льных тканей. При понижении температуры ниже точки замерзан˝ия физиологической среды прекращается действие ферментов,˝ однако при повышении температуры их каталитическая активнос˝ть восстанавливается.

Влияние рН среды. Каждая молекулярная форма фермента (изофермент) проявляет каталитическую активность в узко˝м интервале рН среды, поскольку от концентрации водородных ио˝нов

зависит состояние ионизации молекулы субстрата и группи˝ровок

в активном центре ферментного белка, которое обеспечивае˝т ка-

талитическое действие фермента. Кроме того, концентрация˝ ионов водорода влияет на конформацию активного центра. По˝-

этому даже небольшой сдвиг реакции среды от оптимального зна-

208

среды. Зависимость активности фермента от рН среды показа˝на на рисунке 8.8.

Влияние концентрации фермента и субстрата. Если в физиоло-

гической среде содержится много субстрата и мало фермент˝ного белка, то скорость превращения субстрата в продукты реакц˝ии

будет низкой, так как каждая молекула фермента способна к˝ата-

лизировать превращение определенного количества субстр˝ата в единицу времени. При увеличении числа ферментных молекул

(т. е. концентрации фермента) в среде скорость ферментати˝вной

реакции будет возрастать до тех пор, пока достаточно субс˝трата для полной реализации молярной активности фермента. При

дальнейшем увеличении концентрации фермента скорость р˝еак-

ции уже не возрастает. Следовательно, скорость ферментати˝вной реакции пропорциональна количеству фермента в среде тол˝ько при высокой концентрации субстрата.

Скорость реакции, катализируемой ферментом, зависит такж˝е от концентрации субстрата в физиологической среде при ус˝ловии, что количество фермента остается неизменным. Если в среде˝ находится определенное количество фермента и в нее добавля˝ется субстрат, то вначале скорость ферментативной реакции буд˝ет возрастать пропорционально увеличению концентрации субстрата. Однако в дальнейшем по мере увеличения концентрации с˝убстрата темпы нарастания скорости реакции замедляются, и при определенном количестве субстрата в среде скорость реак˝ции достигает максимального уровня, при котором полностью реал˝изу-

ется молярная активность фермента (рис. 8.9). С этого момента˝ скорость реакции уже не будет возрастать при увеличении к˝оли-

чества субстрата в среде, так как лимитирующим фактором, опре-

деляющим дальнейший ход реакции, становится концентраци˝я фермента.

209

Рис. 8.9. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата:

V — скорость ферментативной реакции; [S] — концентрация субстрата; Vmax — максимальная скорость ферментативной реакции при данном количестве фермента; Кm — константа Михаэлиса фермента

Зависимость скорости ферментативной реакции (V) от концент-

рации субстрата может быть выражена уравнением

[S ]

V+ [S ],=Vmax Km

ãäå Vmax — максимальная скорость реакции при высокой концентра˝ции субстрата, когда в каждый момент времени все молекулы фермента наход˝ятся в соединении с субстратом (насыщение фермента субстратом); [S] — концентрация субстрата; Km — константа Михаэлиса, названная именем Л. Михаэлиса, ко˝торый внес большой вклад в разработку теории ферментативной кинетики.

Константа Михаэлиса выражает сродство фермента к субстр˝ату и служит важной характеристикой ферментного белка. Чем ме˝нь-

ше константа Михаэлиса, тем выше молярная активность ферм˝ен-

та и тем интенсивнее происходит ферментативный катализ. И˝з приведенного выше уравнения можно определить значение к˝он-

станты Михаэлиса:

Следовательно, константа Михаэлиса численно равна конце˝нт-

рации субстрата, при которой скорость реакции, катализиру˝емой

ферментом, достигает 1/2 максимальной.

Для определения константы Михаэлиса экспериментальным путем с использованием чистого фермента находят скорост˝ь катализируемой реакции, включая максимальную при разных знач˝е- ниях концентрации субстрата. Затем изменение скорости фе˝рментативной реакции в зависимости от концентрации субстрат˝а выра-

жают в виде графика, как показано на рисунке 8.9. Если на этом

графике отметить скорость, равную половине максимальной˝, и опустить перпендикуляр на ось абсцисс, то он укажет конце˝нтрацию субстрата, численно равную константе Михаэлиса.

Активаторы ферментов. Для поддержания молекулы фермента в активном состоянии необходимо наличие в среде определен˝ных

210