Вопрос19.Возникновениеиразвитиегистологииицитологиикаксамостоятельныхнаук.

Методыисследованиявгистологии,цитологиииэмбриологии.

Дляпрогрессагистологии,цитологиииэмбриологиибольшоезначениеимеетвнедрениедостижений физики и химии, новых методовсмежных наук — биохимии, молекулярной биологии, геннойинженерии. Современные методы исследования позволяют изучать ткани как единое целое и выделять из нихотдельныетипыклетокдляизученияихжизнедеятельностивтечениедлительноговремени,выделятьотдельныеклеточныеорганеллыисоставляющиеихмакромолекулы(например,ДНК),исследоватьихфункциональныеособенности.Такиевозможностиоткрылисьвсвязиссозданиемновыхприборовитехнологий—различныхтиповмикроскопов,компьютернойтехники,рен-тгеноструктурногоанализа,примененияметодаядерно-магнитногорезонанса(ЯМР),радиоактивныхизотоповиавторадиографии,электрофорезаихроматографии,фракционированияклеточногосодержимогоспомощьюультрацентрифугирования,разделенияикультивированияклеток,получениягибридов;использованиябиотехнологических методов — получения гибридом и моноклональных антител, рекомбинантных ДНК и др.Такимобразом,биологическиеобъектыможноизучатьнатканевом,клеточном,субклеточномимолекулярном уровнях.

Главнымиэтапамицитологическогоигистологическогоанализаявляютсявыборобъектаисследования,подготовкаегодляизучениявмикроскопе,применениеметодовмикроскопирования,качественныйиколичественныйанализизображений.Объектамиисследованияслужатживыеификсированныеклетки и ткани, их изображения,полученные в световых и электронныхмикроскопах или нателевизионномэкранедисплея.Существуетрядметодов,позволяющихпроводитьанализуказанныхобъектов.МетодымикроскопированиягистологическихпрепаратовОсновнымиметодамиизучениябиологическихмикрообъектовявляютсясветоваяиэлектроннаямикроскопия,которыеширокоиспользуются вэкспериментальной иклинической практике.

• Микроскопирование— основной метод изучения микрообъектов. С момента создания иприменения первых микроскопов они постоянно совершенствовались.Современные микроскопы-разнообразныесложныеоптическиесистемы,обладающиевысокойразрешающейспособностью.

• Дляизучениягистологическихпрепаратов применяютразнообразныевидысветовыхмикроскопов иэлектронныемикроскопы.

Световаямикроскопия.Дляизучениягистологическихмикрообъектовприменяютобычныесветовые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с различнымидлинами волн. В обычныхсветовых микроскопах источником освещения служит естественный илиискусственный свет. Таким образом, в световом микроскопе можно видеть не толькоотдельные клеткиразмером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточныеструктуры — органеллы, включения. Для усиленияконтрастностимикрообъектов применяютихокрашивание.

Ультрафиолетоваямикроскопия.Эторазновидностьсветовоймикроскопии.Вультрафиолетовом микроскопе используют более короткиеультрафиолетовые лучи с длиной волныоколо 0,2 мкм. Разрешаемое расстояние здесь в 2 раза меньше, чем в обычных световых микроскопах.Полученное вультрафиолетовых лучах невидимое глазом изображение преобразуется в видимое спомощьюрегистрациинафотопластинкеилипутемпримененияспециальныхустройств(люминесцентныйэкран,электронно-оптическийпреобразователь).

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Явленияфлюоресценции заключаются втом, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденноесостояние. Обратныйпереход из возбужденного состояния в нормальное происходит сиспусканиемсвета, но с большей длиной волны. В флюоресцентном микроскопе в качестве источников света длявозбужденияфлюоресценцииприменяютртутныеиликсеноновыелампысверхвысокогодавления,обладающиевысокойяркостьювобластиспектра.Длинасветовойволныфлюоресценциивсегдабольшедлиныволнывозбуждающегосвета,поэтомуихразделяютспомощьюсветофильтровиизучают изображение объекта только в свете флюоресценции. Различают собственную, или первичную,и наведенную, или вторичную, флюоресценцию. Любая клетка живого организма обладает собственнойфлюоресценцией, однако оначасто бываетчрезвычайно слабой.

Фазово-контрастная микроскопия. Этот метод служит для получения контрастных изображенийпрозрачных и бесцветных живых объектов,невидимых при обычных методах микроскопирования. Какуже указывалось, в обычном световом микроскопе необходимая контрастность структурдостигается спомощьюокрашивания.Методфазовогоконтрастаобеспечиваетконтрастностьизучаемыхнеокрашенных структур за счет специальнойкольцевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и такназываемой фазовой пластинки,находящейся в объективе. Такая конструкция оптикимикроскопа даетвозможностьпреобразоватьневоспринимаемыеглазомфазовыеизмененияпрошедшегочерезнеокрашенныйпрепаратсветавизменениеегоамплитуды,т.е.яркостиполучаемогоизображения.Повышениеконтрастапозволяетвидетьвсеструктуры,различающиесяпопоказателюпреломления.

Микроскопия в темном поле.В темнопольном микроскопе только свет, который дастдифракциюструктурвпрепарате,достигаетобъектива.Происходитэтоблагодаряналичиювмикроскопеспециальногоконденсора,которыйосвещаетпрепаратстрогокосымсветом;лучиотосветителя направляются сбоку. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препаратеотражаютсвет,которыйдалеепопадаетвобъектив.Разрешениеэтогомикроскопанеможетбытьлучше,чемусветлопольногомикроскопа,таккакиспользуетсятакаяжедлинаволны.Ноздесьдостигается больший контраст. Он используется для изучения живых объектов, авторадиографическихобъектов,напримерзеренсеребра,которыевыглядятсветлыминатемномполе.Вклиникеегоприменяютдляизучениякристалловвмоче.

Интерференционнаямикроскопия.Разновидностямифазово-контрастногомикроскопаявляютсяинтерференционныймикроскоп,которыйпредназначендляколичественногоопределениямассы ткани, и дифференциальный интерференционный микроскоп, который специально используютдля изучения рельефаповерхностиклетокидругихбиологическихобъектов.

В интерференционном микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: одинпроходит через обьект и изменяет по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах обьсктиваоба пучка соединяются и интерферируют между собой. В результате строится изображение, в которомучастки микрообъекта разной толщины и плотности рапичаютсяпо степени контрастности. Проведяколичественнуюоценкуизменений,определяютконцентрациюимассусухоговещества.

Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы позволяют изучатьживые клетки. В нихиспользуетсяэффектинтерференции,возникающийприкомбинациидвухнаборовволн,которыйсоздаетизображениемикроструктур.Преимуществомфазово-контрастной,интерференционнойитемнопольной микроскопии являетсявозможность наблюдатьклеткив процесседвиженияи митоза.При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью цейтраферной (покадровой)микрокиносъсмки.

Поляризационнаямикроскопия.Поляризационныймикроскопявляетсямодификациейсветового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра — первый (поляризатор)между пучком света, и объектом, а второй между линзой объектива и глазом. Через первый фильтр светпроходиттольководномнаправлении,второйфильтримеетглавнуюось,котораярасполагаетсяперпендикулярно первому фильтру, и он не пропускает свет. Получается эффект темного поля. Обафильтра могут вращаться, изменяя направление пучка свста. Если анализатор повернуть на 90" поотношению к поляризатору, то свет проходить через них не будет. Структуры, содержащие продольноориентированныемолекулы(коллаген,микротрубочки,микрофиламенты),икристаллическиеструктуры при изменении оси вращения проявляются как светящиеся. Способность кристаллов илипаракристаллическихобразованийкраздвоениюсветовойволнынаобыкновеннуюиперпендикулярнуюкнейназываетсядвойнымлучепреломлением.Такойспособностьюобладаютфибриллыпоперечнополосатыхмышц.

Электроннаямикроскопия.Большимшагомвпередвразвитиитехникимикроскопиибылисозданиеиприменениеэлектронногомикроскопа.Вэлектронноммикроскопеиспользуетсяпотокэтектроновсболеекороткими,чем всистовом микроскопе,длинамиволн.

В настоящее время широко используютсятрансмиссионные (просвечивающие) электронныемикроскопы(ТЭМ)иска-нирующие(растровые)электронныемикроскопы (СЭМ).

С помощью ТЭМ можно получить лишь плоскостное изображение изучаемого микрообъекта. ДляполученияпространственногопредставленияоструктурахприменяютСЭМ,способныесоздаватьтрехмерноеизображение.

Растровыйэлектронныймикроскопработаетпопринципусканированияэлектронныммикрозондомисследуемогообъекта,т.с.последовательно«ощупывает*остросфокусированнымэлектронным пучком отдельные точки поверхности. Для исследования выбранного участка микрозонддвигаетсяпоегоповерхностиподдействиемотклоняющихкатушек(принциптелевизионнойразвертки).Такоеисследованиеобъектаназываетсясканированием(считыванием),арисунок,покоторомудвижетсямикрозонд,—растром.Полученноеизображениевыводитсянателевизионныйэкран,электронный лучкоторого движется синхронно смикрозондом.

Главнымидостоинствамирастровойэлектронноймикроскопииявляютсябольшаяглубинарезкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от десятков до десятков тысяч раз) ивысокая разрешающаяспособность.

Электронная микроскопия по методу замораживания— ска-швания применяется для изучениядеталей строения мембран и межклеточных соединений Для изготовления сколов клетки замораживаютпринизкойтемпературе(—160С).Приисследованиимембраныплоскостьсколапроходитчерезсередину бислоя липидов. Далее на внутренние поверхности полученных половинок мембран напыляютметаллы(платина,палладий,уран), изучаютихспомощьюТЭМимикрофотографии

МетодкриозлектронноймикроскопииБыстрозамороженныйтонкийслойобразцатканипомешаютнамикроскопическую решепсуиисследуютв вакуумемикроскопа.

Методы замораживания — скалывании и замораживания — позволяют изучать нефиксированныеклеткибез образованиян них артефактов.вызываемых фиксацией.

Методыконтрастированиясолямитяжелыхметалловпозволяютисследоватьвэлектронноммикроскопе отдельные макромолекулы — ДНК, крупных белков (например, миозин) При негативномконтрастированииизучаютагрегатымакромолекул(рибосомы,вирусы)либобелковыефиламенты(актиновыенити)Электроннаямикроскопамультратонкихсрезов,полученныхметодомкриоулыпромикротииии Приэтомметодекусочкитканей без фиксации и заливки в твердыесредыбыстро охлаждают в жидком азоте. Это обеспсчивает торможение метаболических процессов меток иперехододыизжилкойфазывтвердуюДалееблокирежутнаульграмикротомепринизкойтемпературе.Такой метод приготовления срезов обычно используют для определения активности ферментов. а такжедляпроведенияиммуиохимичсскихреакцийДлявыявленияантигеновприменяютантитела,связанныесчастицамиколлоидногозолота,локализациюкоторого легковыявитьнапрепаратах.

Методысверхвысоковольтноймикроскопии.Используют-электронныемикроскопысускоряющимнапряжениемдо3ООООООВПреимуществоэтихмикроскоповвтом.чтоонипозволяютисследоватьобъектыбольшойтолщины,таккакпривысокойэнергииэлскгроновонименьшепоглощаютсяобъектомСтереоскопическаясъемкапозволяетполучатьинформациюотрехмернойорганизациивнутриклеточных структурсвысоким разрешением.

Рентгеноструктурныйанализ.Дляизученияструктурымакромолекулнаатомарномуровнеприменяют методы с использованием рентгеновских лучей. Молекулы, образующие крис-таллическуюрешетку, изучают с помощью дифракционных картин, которые регистрируют на фотопластинке в видемножествапятенразличнойинтенсивностиИнтенсивностьпятензависитотспособностирагличных

объектовврешеткерассеиватьизлучениеПоложениепятенвдифракционнойкартинезависитотположенияобъектавсистеме,аихинтенсивностьсвидетельствуетоеговнутреннейатомнойструктуре.

Успехи гистологии как науки о строении и происхождении тканей и их компонентов преждевсегосвязанысразвитиемтехники,оптикииметодовмикроскопирования.Микроскопическиеисследования позволили накопить данные по тонкому строению организма и на этом основании сделатьтеоретические обобщения. В истории учения отканях и микроскопическом строении органов следуетразличатьтри периода:1-й— домикроскопический (продолжительностью около 2000 лет),2-й—микроскопический(около300лет),3-й—современный,сочетающийдостижениявобластиэлектронноймикроскопии,иммуноцитохимии,цитофо-тометрииидр.(ссерединыXXстолетия).

Первый период, наиболее продолжительный (с IV в. до н.э. и досередины XVII в.), являетсясобственнопредысториейгистологическойнауки,основаннойнамакроскопическойтехнике.Вэтотпериодфактическисоздавалисьлишьобщиепредставленияотканяхкакоб«однородных»частяхорганизма,отличающихсядруготдругафизическимисвойствами(«твердые»,«мягкие»),удельнымвесом («тонущие в воде», «нетонущие») и пр. Но так как представления о тканях в то время складывалисьлишь наосновании анатомического расчленения трупов, то все классификации тканей строились на ихвнешнем сходстве и различиях. Вследствие этого в одну группу попадали иногда такие различные ткани,как нервная исоединительная, поэтому в середине XVII в., когда английским физиком Р.Туком былусовершенствованмикроскоп,позволившийизучитьтонкоестроениетканейрастенийиживотных,начинаетсявторойпериодвученииотканях.Сэтоговремениусилилисьразработкатехническихметодов исследования невидимых невооруженным взглядомструктурных единиц тканей и накоплениефактическогоматериалаоб ихстроении.

Вэтотпериод«зудпознания»побуждалимногихисследователейк микроскопическимисследованиям.ПервыемикроскопистывторойполовиныXVIIв.—физикР.Гук,анатомМ.Мальпиги,ботаникН.Грю,оптик-любительА.Левенгукидр.спомощьюмикроскопаописалистроениекожи,селезенки,крови,мышц, семеннойжидкостиидр.Каждоеисследованиепосуществуявлялосьоткрытием,котороеплохоуживалосьсметафизическимвзглядомнаприроду,складывавшимсявеками.Случайныйхарактероткрытий,несовершенствомикроскопов,метафизическоемировоззрениенепозволиливтечение100лет(ссерединыXVIIв.досерединыXVIIIв.)сделатьсущественныешагивперед в познании закономерностей строения животных и растений, хотя и делались попытки обобщений.ВконцеXVIII—началеXIXв.трудамимногихотечественных (петербургских),атакжеголландскихученыхимастеровбылисозданы ахроматическиемикроскопы,которыесделалиболеедостоверными микроскопическиенаблюденияипозволилиперейтиксистематическомуизучениюструктурныхэлементовсамыхразнообразныхживотныхирастительных организмов.Применениеахроматическогомикроскопавнаучныхисследованияхпослужилоновымимпульсомкразвитию

гистологии.

В начале XIX в.сделано первое изображение ядер растительных клеток.Я. Пуркинье(в 1825—1827 гг.) описал ядро в яйцеклетке курицы, а затем ядра в клеткахразличных тканей животных. Позднееим было введено понятие «протоплазма» (цитоплазма) клеток, охарактеризованы форма нервных клеток,строениежелезидр.Р.Броунсделалзаключениеотом,чтоядроявляетсяобязательнойчастьюрастительной клетки. Таким образом, постепенно сталнакапливаться материал о микроскопическойорганизацииживотныхи растенийи строении«клеток», увиденныхвпервые Р. Гуком. Завершениемэтого периода являются исследования А.Дютроше, П. Ф. Горянинова, Г. Валентина, Я. Генле, М.Шлейдена и особенно Т. Шванна, который обобщил все предыдущие исследования и сформулировалклеточнуютеорию.Т.Шваннрассматривалклеткукакуниверсальныйструктурныйкомпонентживотногоирастительногомира.Этопоставилонаматериалистическуюосновубиологиюипатологию.

Созданиеклеточнойтеорииоказалоогромноепрогрессивноевлияниенаразвитиебиологииимедицины. В середине XIX в. начался периодбурного развития описательной гистологии. На основеклеточной теории были изучены состав различных органов и тканей, их развитие, чтопозволило ужетогда создать в основных чертах микроскопическуюанатомию и уточнить классификацию тканей сучетом их микроскопического строения (А. Кёлликер и др.). Но научная мысль во второй половине XIX в.немоглаплодотворноразвиватьсябездальнейшихуспеховгистологическойтехникииметодовмикроскопическогоисследования.

В этот период были введены в практику и усовершенствованы водные и масляныеиммерсионныеобъективы, изобретен микротом, применены новые фиксаторы(формалин, осмиевая кислота, хромоваякислота).Весьмаплодотворнымоказалсяметодимпрегнациисолямисеребра,разработанныйитальянским ученымК. Гольджи, описавшим внутриклеточный сетчатый аппарат (аппарат Гольджи).Этот метод и его модификации позволили провести фундаментальные исследования нервной системы(Р.Кахаль)исоздатьосновынейроги-стологии.ПризнаниемнаучныхзаслугК.ГольджииР.Кахаляявилось присуждение им в 1906 г. Нобелевской премии. В последней четверти XIX в. были открыты идругиеорганеллыклетки.

Вконце XIX в. были заложены основы цитологии. Но микроскопирование фиксированных клеток непозволяло говорить о процессахжизнедеятельности в них. Поэтому внимание ученых привлекли методыкультивирования клеток и тканей. Методы прижизненного введения красителей, примененные многимиисследователями в то время, введение инородных тел в организм и другие методы сделали возможнымизучение физиологии гистологическихструктур. В 1900 г.Н. М. Гайдуковымбыл предложен методмикроскопирования живых объектов в темномполе. Был изобретенмикроманипулятор,с помощьюкоторого можно было производить операции наотдельных клетках (удаление ядер, разрезы клеток и др.)вцеляхвыясненияролиизначенияихвжизнедеятельностиорганизма.