2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)
.pdfРисунок 11 - Вскрытие куриных эмбрионов.
Нередко при вскрытии эмбриона не удается обнаружить ни одного признака размножения вируса, хотя он и находится в исследуемом материале. Такой пас-
саж, как уже говорилось, называется «слепым».
Вскрытие эмбриона и получение вируссодержащего материала (рисунок 11).
Вскрывают эмбрионы с целью обнаружения признаков размножения в них виру-
сов и получения вируссодержащего материала.
Перед вскрытием скорлупу обрабатывают йодированным спиртом (иногда еще фламбируют). Вскрытие производят в боксе, пользуясь стерильными инстру-
ментами и посудой. Скорлупу срезают над той воздушной камерой (естественной или искусственной), через которую заражали. При этом яйцо держат под неко-
51
торым углом, чтобы скорлупа не упала внутрь. Ножницы не должны касаться и повреждать лежащую под воздушной камерой оболочку, для этого срез должен проходить несколько выше границы воздушной камеры.
Обнажившуюся ХАО осматривают, приподнимая ее пинцетом с целью уста-
новления в ней патологоанатомических изменений. Часть ХАО, на которую был нанесен вируссодержащий материал, имеет обычно наиболее выраженные изме-
нения. Для более тщательного осмотра ее и взятия этой части приподнимают пинцетом ХАО в этом месте и срезают ножницами возможно больше. Для осмот-
ра и взятия всей ХАО удаляют зародыш, желточный мешок и белок, а ХАО от-
слаивают от внутренней поверхности скорлупы, извлекают и переносят в сте-
рильную чашку Петри с физраствором. Оболочку отполаскивают, а затем двумя пинцетами расправляют так, чтобы она лежала в один слой и могла быть осмот-
рена по всей поверхности. Для того чтобы патологоанатомические изменения оболочки были видны более отчетливо, под чашку Петри подкладывают лист черной бумаги.
Аллантоисную жидкость в количестве до 10 мл отсасывают пипеткой, кото-
рой прокалывают подскорлупную оболочку и ХАО над телом зародыша. Такое направление пипетки предотвращает случайный разрыв стенки желточного меш-
ка и смешивание его содержимого с набираемой аллантоисной жидкостью.
Амниотической жидкости удается отсосать до 1 мл. Для этого после удале-
ния аллантоисной жидкости пипетку вводят в амнион между головой и телом за-
родыша под его шеей.
Для получения стенки желточного мешка как вируссодержащего материала желток извлекают на чашку Петри, стенку его разрезают ножницами и отполаски-
вают от содержимого в физрастворе. Тело зародыша извлекают, удерживая его за шею.
Перечень контрольных вопросов:
1.Цели использования куриных эмбрионов в вирусологии.
2.Преимущества куриных эмбрионов перед лабораторными животными.
3.Взаимосвязь между возрастом куриного эмбриона и методом заражения.
52
4.Овоскопирование.
5.Заражение эмбрионов в аллантоисную полость.
6.Заражение эмбрионов на хориоаллантоисную оболочку.
7.Заражение эмбрионов в желточный мешок.
8.Заражение эмбрионов в амниотическую полость.
9.Заражение эмбрионов в тело зародыша.
10.Заражение эмбрионов в кровеносные сосуды.
11.Выявление вируса из эмбриона при помощи реакции гемагглютинации.
Тема 1.5. Культуры клеток, их получение и использование в вирусологиче-
ской практике
Цель: изучить способы применения культур клеток в вирусологической прак-
тике.
Содержание:
виды культур клеток;
хранение культур клеток;
контаминация культур клеток;
растворы;
питательные среды;
посуда;
требования к культурам клеток;
подбор культур клеток;
заражение культур клеток;
культивирование культур клеток;
цитопатическое действие вируса на клетки;
реакция гемадсорбции;
метод бляшкообразования;
цветная проба;
обнаружение внутриклеточных телец включений;
интерференция;
53
получение первично-трипсинизированных культур клеток из кожно-
мышечной ткани развивающихся куриных эмбрионов.
Культура клеток - это клетки многоклеточного организма, живущие и раз-
множающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro) (рисунок 12).
Виды культур клеток
Первично-трипсинизированные культуры клеток - клетки, полученные непо-
средственно из органов или тканей организма,
растущие in vitro в один слой. КК можно по-
лучить из любого органа или ткани человека или животного.
Для получения первичных клеток от здо-
рового животного не позднее 2-3 ч после убоя берут соответствующие органы или ткани, из-
мельчают их на кусочки (1-4 мм) и обрабаты-
вают ферментами (трипсином), разрушающи-
ми межклеточные вещества. Полученные при этом отдельные клетки суспендируют в пита-
тельной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термо-
стате при 37 °С. Клетки прикрепляются к
стеклу и начинают делиться. Размножаясь, Рисунок 12 - Культуры клеток. клетки размещаются на поверхности стекла и при его полном покрытии в один
слой контактируют друг с другом и прекращают делиться. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку - монослой.
Обычно монослой формируется через 3-5 дней. Скорость его формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факторов. Питательную среду меняют по мере за-
грязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизне-
способность в течение 7-21 дня (в зависимости от вида клеток и состава пита-
54
тельной среды). Интенсивность размножения клеток и состояние монослоя конт-
ролируют визуально под малым увеличением микроскопа (объектив х10).
Для культивирования вирусов используют молодые культуры клеток (как только сформировался монослой).
Субкультуры. Получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, пу-
тем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, растущая в новой пита-
тельной среде и пересева на новые матрасы или пробирки. Через 2-3 суток фор-
мируется монослой.
Субкультуры получают от 2-5 пассажей (перевивок) и очень редко до 8-10.
Последующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели.
Если клеточные культуры прошли более 10 пассажей, они уже на стадии перехода к перевиваемым культурам клеток.
Перевиваемые культуры клеток - это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды).
Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культи-
вирования.
Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных клеток он диплоидный), стабильны в условиях рос-
та in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью (ограничивает использование перевиваемых культур клеток для культивирования вирусов при производстве вакцин).
Диплоидные культуры клеток Это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограни-
ченный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами роста, сохраняющая в про-
цессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от кон-
таминантов и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации хо-
мячкам.
55
Диплоидные клетки получены из различных тканей эмбриона человека и жи-
вотных. Диплоидные клетки в отличие от перевиваемых имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50±10, затем количе-
ство делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Однако диплоидные клетки могут быть использованы в течение длительного времени, т.к. при каждом пассаже часть клеток можно заморозить (минус 196 °С) и при необходимости вос-
становить.
Диплоидные клетки имеют преимущества перед перевиваемыми и первич-
ными клетками: 10-12 дней они могут быть в жизнеспособном состоянии без сме-
ны питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспо-
собны в течение 4 недель; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам.
Суспензионные культуры клеток. Выращивание вирусов в суспензионных культурах клеток помогло в промышленном производстве вакцин и диагностику-
мов. Но только перевиваемые клетки хорошо культивируются в суспензии.
На микроносителях культивируемые клетки формируют монослой. Этот спо-
соб позволяет методами суспензионного культивирования выращивать зависимые от прикрепления к твердому субстрату клетки: первичные, субкультуры, дипло-
идные. Эти клетки принято называть поверхностно зависимыми.
Хранение культур. Наиболее простой метод консервирования культур - хра-
нение их при 4 °С до 1-6 недель. Успешно применяют хранение клеточных штам-
мов в условиях сухого льда (минус 78 °С) и жидкого азота (минус 196 °С). Клетки снимают с матрасов, суспендируют в концентрации 106 в 1 мл питательной среды,
содержащей в качестве защитных веществ 10-40 % сыворотки и 10 % очищенного стерильного глицерина. Затем клеточную суспензию разливают в ампулы, запаи-
вают и выдерживают 1-3 ч при 4 °С, после чего замораживают клетки в смеси этилового спирта с сухим льдом. Скорость охлаждения не должна превышать 1 °С
в 1 мин. При снижении температуры до минус 25 °С ампулы помещают для хра-
нения в сухой лед. Если для хранения используют жидкий азот, то ампулы с клет-
ками охлаждают до минус 70 °С и кладут в жидкий азот. Хранение клеток в жид-
56
ком азоте в течение ряда лет не изменяет их активность и чувствительность к ви-
русам.
Восстанавливают замороженные клетки: ампулу с замороженными клетка-
ми быстро погружают в водяную баню на 1-2 мин при легком встряхивании, за-
тем клетки выливают в матрас, добавляют соответствующее количество ростовой среды и культивируют в термостате при 37 °С. Для удаления глицерина питатель-
ную среду заменяют на следующий день после посева.
При транспортировке клеток матрасы с выросшим монослоем заливают средой доверху и закрывают резиновой пробкой. В лаборатории питательную среду сливают и используют при культивировании этих клеток в виде добавок к питательной среде, применяемой в данной лаборатории.
Можно транспортировать и клеточную суспензию при 4 °С. При благоприят-
ных условиях транспортировки, исключающих перегревание и замораживание клеток, 80-90 % из них сохраняют жизнеспособность до 7-8 дней.
Контаминация культур. Работа с культурами клеток требует постоянного контроля на отсутствие посторонних агентов (контаминантов) - вирусы, бактерии,
грибы, микоплазмы и клетки других культур. Микоплазмы - одни из наиболее частых контаминантов, особенно в перевиваемых линиях клеток. Резкое закисле-
ние питательной среды в культуральных флаконах и опалесценция ее могут быть следствием контаминации культур микоплазмами. Необходим тест-контроль на отсутствие микоплазмоконтаминации (посев на питательные среды, тест-
культуры, электронно-микроскопические).
В случае контаминации культуры клеток уничтожают, а культивирование во-
зобновляют из резервных расплодок, хранящихся в жидком азоте. Только редкие и уникальные культуры подлежат деконтаминации.
Предупредить размножение и подавить попавшие в культуры клеток бакте-
рии удается с помощью противомикробных препаратов (антибиотиков), добав-
ляемых в ростовые среды непосредственно перед их использованием. Эти пре-
параты следует строго дозировать. Выбор эффективного препарата или комплекса препаратов зависит от чувствительности к ним конкретных контаминантов. Их
57
использование - необходимое условие при возрастании риска контаминации в процессе получения первичных культур при крупномасштабном суспензионном выращивании клеток, массовом производственном культивировании перевивае-
мых клеток, а также во всех случаях объединения клеточного материала.
Растворы. Наиболее широко используют при работе с культурами растворы Хенкса и Эрла, которые готовят на бидистиллиро-
ванной воде с добавлением различных солей и глю-
козы (рисунок 13).
Растворы Хенкса и Эрла – это сбалансирован-
ные солевые растворы, которые используют для приготовления питательных сред, т.к. они обеспечи-
вают сохранение рН, осмотическое давление и соот-
ветствующую концентрацию необходимых неорга-
нических веществ. Их применяют при различных манипуляциях с культурами (отмывание от росто-
вых сред, разведение вируса и т. д.).
При культивировании клеток применяют дис-
пергирующие растворы трипсина и версена. Раствор трипсина (0,25 %-ный на фосфатном буфере) ис-
пользуют для разделения кусочков тканей на отдельные клетки и для снятия слоя клеток со стекла. Рисунок 13 - Раствор Хенкса.
Раствор версена - натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (0,02 %-
ный на растворе Хенкса) - используют для снятия клеток со стекла. Все растворы стерилизуют при соответствующих режимах.
Питательные среды различают:
Естественные среды состоят из смеси солевого раствора (Хенкса, Эрла), сы-
воротки крови (животных или человека), тканевого (эмбрионального) экстракта
(эмбрионов кур, коров, человека), коровьей амниотической жидкости и т. д. Ко-
личество каждого компонента в разных примесях сред значительно варьирует.
Используют эти среды редко.
58
В настоящее время применяют в основном искусственные питательные сре-
ды. К ним относят ферментативные гидролизаты различных белковых продуктов:
гидролизат лактальбумина, мышечный ферментативный гидролизат, фермента-
тивноказеиновый дрожжевой гидролизат, гемогидролизат, аминопептид и др.
Наиболее широко в вирусологии используют 5 % гидролизат лактальбумина, 5 %
и 2,5 % гемогидролизат.
Из синтетических сред наиболее широкое применение нашли среда 199 (ри-
сунок 14) и среда Игла (рисунок 15). В состав среды 199 входит более 60 компо-
|
нентов: |
20 аминокислот, 17 |
|
|
вита- |
||||||||||||
|
минов, компоненты нуклеи- |
|
|
|
но- |
||||||||||||
|
|
|
|
||||||||||||||
|
вых кислот, |
источники |
|
|
|
пи- |
|||||||||||
|
|
|
|
||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
дов, 8 минеральных солей |
|
|
|
и |
||||||||||||
|
другие вещества. В со- |
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
став среды Игла также |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
входит |
не менее |
60 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
компонентов, |
вклю- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
чающих |
аминокисло- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
ты, витамины, углево- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
ды и т.д. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
Во |
все питатель- |
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
|
ные среды и некоторые |
|
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
солевые |
растворы |
до- |
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
бавляют индикатор фено- |
|
|
|
|
||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Рисунок 15 - Среда Игла. |
ловый |
красный |
|
|
|
|
|
|
|
Рисунок 14 - Среда 199. |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
(0,002 %) для определения концентрации водородных ионов (рН). В принятой концентрации он не оказывает токсического воздействия на клетки и вирусы. При снижении рН среда желтеет, что позволяет определять момент ее закисления про-
дуктами метаболизма клеток до уровня, требующего замены среды на свежую;
при сдвигах рН в щелочную сторону растворы принимают красно-малиновый
59
цвет. При нейтральном значении рН (7,2 - 7,4) цвет среды оранжево-красный. Для регулирования рН солевых растворов и питательных сред используют 7,5 % би-
карбонат натрия (NaHC03) и 3 % уксусная кислота (СН3СООН).
Для уничтожения микрофлоры перед использованием в среды добавляют ан-
тибиотики: пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл. Для подавления плесени используют натриевую соль нистатина по 100 мкг на 1 мл среды.
Все питательные среды принято делить на две группы:
ростовые - обеспечивают жизнь и размножение клеток. Содержат 2-10
%сыворотки крови, применяются в первые дни культивирования клеток;
поддерживающие – обеспечивают жизнедеятельность клеток, но не их размножение. Они не содержат сыворотки крови, используются после заражения КК вирусами.
Сыворотка крови крупного рогатого скота - обязательный компонент рос-
товых питательных сред. В ее состав входит ряд БАВ, необходимых для роста клеток in vitro. Содержащиеся в сыворотке активная фракция альбуминов и фету-
ин способствуют прикреплению клеток к поверхности стекла. Сыворотка пред-
ставляет собой чрезвычайно сложную смесь мелких и крупных молекул, способ-
ных как вызывать, так и тормозить рост клеток. К главным функциям сыворотки относятся: обеспечение гормональными факторами, стимулирующими рост кле-
ток и их функции; обеспечение факторами прикрепления и распластывания кле-
ток; обеспечение транспортными белками, переносящими гормоны, минеральные вещества, липиды и т.д. Белки сыворотки, прямо и специфически участвующие в стимуляции клеточного деления, называются факторы роста. Применяют сыво-
ротки коров или сыворотки телят. Самая лучшая сыворотка для культур клеток -
сыворотка эмбрионов коров. При получении сыворотки следует соблюдать стро-
гую стерильность. Каждая серия сыворотки проходит контроль на стерильность и токсические свойства по отношению к культурам.
Посуда. Должна быть стерильной, обезжиренной, не обладать токсическим действием. Для культивирования клеток используют пробирки, матрасы на 50, 100, 250, 500, 1000 и 1500 мл, роллерные колбы на 500, 1000, 2000 мл, различные
60